Medio de cultivo para el aislmiento e identificacion de trypanosoma cruzi

PRACTICA No. 17 MEDIO DE CULTIVO PARA EL AISLMIENTO E IDENTIFICACION DE TRYPANOSOMA CRUZI
(N.N.N.)
OBJETIVO
Aprender a realizar el cultivo para Trypanosoma cruzi
Aislar eidentificar Trypanosoma cruzi de un medio de cultivo.
INTRODUCCION
Los medios de cultivo son muy útiles para realizar un diagnostico mas completo en las protozoosis humanas, sin embargo muy pocas veces se realizan ya que son pocos los laboratorio de Parasitología que están al alcance de estos estudios clínicos.
En la realización de un cultivo se crea un medio que le proporcione al parasito, hongo obacteria un medio óptimo el cual cuente con los nutrientes que necesita para su multiplicación.
El cultivo en medio difásico de agar sangre, conocido como N.N.N. es útil para el diagnostico de Trypanosoma cruzi.
Desde 1903 en que Novy y MacNeal publicaron su nota preliminar sobre el cultivo de T. brucei, este medio ha demostrado, a través del tiempo, su eficacia para aislamento y cultivo de T.cruzi y Leishmania spp. es un medio sumamente económico.
T. cruzi produce la enfermedad que se conoce como tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas. Este parasito presenta cuatro estadios: tripomastigotes sanguíneos y metaciclicos; epimastigotes y promastigotes.

MATERIAL

Autoclave
Perlas de vidrio
Frascos Erlenmeyer o tubos con tapón de rosca
Matraces
Estufa
Matrazvolumétrico 1000 ml
Tubos de ensaye
Baño maria
Jeringa
Torundas con alcohol

REACTIVOS
Agar nutritivo 14 g
Cloruro de sodio 14 g
Agua destilada
Cloruro de potasio 0.2g
Cloruro de calcio anhidro 0.2g
Bicarbonato de sodio 0.2g

MUESTRA BIOLOGICA REQUERIDA
75 ml de sangre de conejo o borrego.
1 a 3 ml de sangre.
Nota
La sangre de conejo se obtiene por punción cardiaca en condiciones deasepsia.

PROCEDIMIENTO

Medio bifásico a base de agar-sangre NNN (Novy-Nicolle-McNeal)

Fase solida
Pesar 14 g de agar nutritivo y 6 g de cloruro de sodio.
Colocar los ingredientes en un matraz erlenmeyer, mezclarlos con 900 ml de agua destilada.
Poner en baño maría, hasta llevar a ebullición para fundir el agar mezclando bien por agitación para no quemar, teniendo mucho cuidadode no tirarlo.
Esterilizar en autoclave por 20 minutos a 120 libras.
Obtener 75 ml de sangre de conejo o borrego, se desfribina y se agregan al agar enfriado a 58°, mezclando suavemente pero sin demorar mucho ya que el medio se solidifica alrededor de ésta temperatura.

Desfibrinar: La desfibrinación es la desaparición de la fibrina de la sangre, con lo cual la sangre se vuelveincoagulable. Para Desfibrinar es necesario colocar la sangre en un matraz con perlas de vidrio y agitar delicadamente. El principal inconveniente se pierden considerables volúmenes de sangre desfibrinada al sacar el coagulo junto con las perlas.

Poner rápidamente el medio en frascos Erlenmeyer o tubos con tapón de rosca (utilizar 2-3 mL de esta mezcla), los tubos se inclinan para formar bisel ylos matraces se dejan verticales, hasta solidificación del medio, de preferencia en hielo o dentro de una refrigeradora, para que se forme agua de condensación, en la cual crecerán los parásitos. Si el agua de condensación se seca o no aparece, se deben agregar gotas de solución salina estéril

Para probar la esterilidad del medio, se incuban así envasados, en estufa a 37°C durante 24 horas.Fase liquida
Solución de Ringer.
Disolver en 500 ml de agua destilada, 8 g de cloruro de sodio, 0.2 g de cloruro de potasio y 0.2 g de cloruro de calcio anhidro.
Se disuelve por separado en 100 ml de agua destilada 0.2 g de bicarbonato de sodio.
Se pone todo en un matraz volumétrico de 1000 ml y se completa el volumen hasta la marca.
SEMBRADO
Para el aislamiento de Trypanosoma...