Medios cultivo

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Sección 7. APÉNDICE
7. APÉNDICE. PREPARACIÓN DE REACTIVOS.

SECCIÓN I. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Determinación de concentración de proteínas por Lowry y Absorbancia a 280 nm
Solución
Método de preparación
Solución de carbonato- Pesar y disolver 10 g de Na2CO3 en un volumen aproximado de
tartrato y cobre (CTC)
60 mL, todavía en agitación añadir 0.1 gde CuSO4 y 0.2 g de
tartrato de Na+ y K+, añadir H2O cuanto baste para 100 mL
10% Dodecil sulfato de 10 g de SDS y disolver con H2O
sodio (SDS o también
llamado lauril sulfato de
sodio)
0.8 NaOH
Reactivo A

3.2 g NaOH para 1000 mL
Mezclar con partes iguales de CTC, 10% SDS, NaOH, 0.8 N y
H2O
Reactivo B
Dilución del reactivo Folin Ciocalteau.
1 Folin Ciocalteau + 5 H2O
Solución estándar de Pesar 100mg y disolver en 100 mL de agua destilada.
albúmina
de
suero
bovino 1mg/mL
SECCIÓN II. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS.
Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino.
Parte I. Extracción y precipitación por salado
Solución
Método de preparación
0.03M KOH
Pesar 1.6833 g de KOH para 1L

Comentarios
Es estable 2 meses a temperatura
ambiente.
Usar cubrebocaspara su preparación.
No almacenar en frío ya que se
precipita a temperaturas menores de
17°C, pero se redisuelve si la
temperatura se eleva.
Se prepara antes de usarse

Guardar la solución en alícuotas a –
20°C

Comentarios
Solución por grupo
Guardar a 4°C.

Parte II. Desalado y purificación por cromatografía de intercambio iónico y de afinidad
Solución
Método de preparación
Comentarios
2.5 %Sephadex-G25 Hidratar 10 g Sefadex-G-25 con 160 mL de agua estéril durante El sefadex hidratado se puede
(p/V)
24 h a 4ºC. Cantidad que alcanza como para 50 columnas.
almacenar a 4°C por al menos un mes.
Los laboratoristas entregarán una
columna
empacada
con
sefadex/equipo.
1

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
Enpacado de la columna
A una columna de cromatografía se le adicionan 2.0 mL
con Sephadex G-25
dela suspensión de Sephadex-G25. Centrifugar a 3,000
rpm durante 5 min, o esperar a que el líquido drene de la
columna. Repetir la operación hasta que la columna
llegue a un volumen final de 1 mL.

Amortiguador Tris-βmercaptoetanol (10 mM
de Tris/HCl pH 8.8; 0.5
mM β-Mercaptoetanol)
400mM PMSF

Sección 7. APÉNDICE
1. Cada vez que se centrifuga la
columna, es importante revisar que
no se hayanproducido burbujas y
que el flujo del líquido sea
constante.
2. Las columnas se pueden reusar
varias veces, mantenerlas
húmedas, tapadas con parafilm y a
4°C. Lavarlas antes de usar.
Para 104 mL disolver 0.126 g Tris en un poco menos de 90 mL Se usará para preparar dos soluciones
de agua destilada, ajustar el pH a 8.8 con HCl, después distintas ver abajo.
adicionar 3.6 µL de β-Mercaptoetanol y ajustarel volumen a 104
mL con agua destilada.
Disolver 0.209 g de PMSF en 3 mL de etanol, mezclar bien y 1. El PMSF; se añade justo antes de
usarse.
almacenar en microtubos de centrífuga a -20°C.
2. Proporcionar por grupo 250 µL de
400 mM PMSF.
84 mL / grupo
Para 13 mL de amortiguador los
A 4 equipos entregarles alícuotas de 13 mL de Tris-βestudiantes añadirán 32.5 µL de 400
mercaptoetanol a los otros 4equipos darles 8 mL a cada uno y
mM PMSF. Para 8 mL añadir 20 µL de
además proporcionar una solución stock de PMSF/grupo para
400 mM PMSF.
añadirle al amortiguador.

Amortiguador Tris-βmercaptoetanol-PMSF
(10 mM de Tris/HCl pH
8.8; 0.5 mM βMercaptoetanol y 1 mM
PMSF).
Macro-Prep
High
S Lavar la matriz con 2 a 3 volúmenes del amortiguador de Proporcionar lavada a los estudiantes
support (BIORAD)equilibrio (de preferencia esterilizar antes el amortiguador).
Guardar a 4°C.
Amortiguador
de 8 mL/ equipo
equilibrio (50 mM de
fosfatos pH 7.0)
Mezclar 30.75 mL 1M K2HPO4 y 19.25 mL de 1M NaH2PO4 y
ajustar el volumen a 1 L (solución suficiente para 8 grupos y
para lavar la matriz).

2

Se sugiere hacer los stocks de 1 M
K2HPO4 y 1M NaH2PO4, ya que
también se utilizará amortiguador de
fosfatos en...