metabolismo del calcio



Licenciatura en Médico Cirujano
Segundo Semestre

Sesión No. 4
Electroforesis en geles de agarosa para caracterización de ADN y
Cuantificación de ADN mediante espectrofotometría


Dra. Rebeca Mejía Elizondo

PRIMAVERA 2013Nombre del alumno (a): OMAR VALDEZ ARREGUIN

FUNDAMENTO
Este proceso se basa en la migración de las moléculas con carga neta de una muestra, cuando es sometida a un campo eléctrico, hacia el polo opuesto de su carga. El método no es tan sencillo: primero hay que saber con qué tipo de moléculas estamos trabajando y de acuerdo a esto se elige el procedimiento y los materiales necesarios.

Hay dosfuerzas que determinan la velocidad con que una molécula migrará: la fuerza eléctrica y la de rozamiento. La primera es la responsable de que la molécula en cuestión sea atraída hacia uno de los electrodos. Por esto es que cuanto mayor sea el cociente carga/masa de la molécula mayor será la aceleración con que se mueva. La fuerza de rozamiento tiene una acción opuesta: a mayor rozamiento, menorvelocidad de migración. Esta fuerza tiene que ver con el tamaño y forma de la molécula que migra, y con las características del medio en que se mueve.

Para realizar la electroforesis se utiliza un medio de migración adecuado, de modo que la separación sea eficiente, ya que se necesita que exista una suficiente fuerza de rozamiento para que las moléculas de distinto tamaño se separen. Para ellose utiliza un gel que consiste en una red compuesta por un polímero orgánico (en este caso usamos agarosa, derivado de un polisacárido de un alga) y que aumenta considerablemente la fricción, impidiendo a la vez la difusión de las moléculas a través del medio acuoso en todas las direcciones. Al colocar las muestras de DNA a través de este gel y someterlo a un campo eléctrico durante cierto tiempo,podemos verlas separadas según su tamaño. La rapidez con que migren las moléculas puede ser regulada por la concentración de agarosa disuelta en buffer que usemos: a mayor concentración, mayor compactación de la red y por tanto menor velocidad de migración. La concentración que elijamos dependerá de lo que se quiera separar en cada corrida.
Una vez separados los DNAs de distintos tamaños, esposible conocer el peso de cada uno ya que el logaritmo del peso molecular es inversamente proporcional a la distancia recorrida desde el lugar de siembra. Es por eso que en cada corrida se hace necesario correr además de las muestras una mezcla de DNAs de pesos conocidos para trazar un gráfico de proporcionalidad. Estas mezclas se consiguen comercialmente y son conocidas como markers.CUESTIONARIO:

1. Calcula la concentración de ADN que pusiste en cada tubo tomando en cuenta la concentración del ADN de esperma de ballena, la dilución y el volumen que tomaste. Incluye tus cálculos.


Tubo
Concentración ADN
(µg/ml)
Concentración ADN
(µg/µl)
1
12
12000
2
1.2
1200
3
3.6
3600
4
6
6000
5
0.12
120
6
0.36
360
7
0.6
600
2. Describa el fundamento de laelectroforesis.
La electroforesis es la separación de partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. Un físico Ruso Alexander Reuss hizo las primeras observaciones del principio de la electroforesis en 1807. En la aplicación del campo eléctrico a una suspensión de arcilla en agua, el observó que las partículas de arcilla se movían hacia el polo positivo. Las observaciones de que laspartículas con carga positiva se movían hacia el polo negativo y las partículas con carga negativa se movían hacia el polo positivo fueron confirmadas por Michael Faraday en Inglaterra y E.H. Bosi-Raymond en Alemania. También se observó que la mayoría de las partículas son ubicadas con cargas son más rápidas en su movimiento y que el número de cargas en exceso en las partículas y el voltaje de la...