Metodo de Bradford

INFORME 11.- Bradford

1. OBJECTIUS
Conèixer la tècnica més habitual en la quantificació de proteïnes
Obtenir el espectre de visible amb el mètode de Bradford.
Calcular la concentració deproteïnes en una o diverses mostres

2. FONAMENT TEÒRIC

El mètode Bradford es basa en utilitzar un colorant hidrofòbic (comassie blue G-250) les dissolucions aquoses en presència d'àcid fosfòric tenenun color marró que al entrar en contacte amb la part hidrofòbic de l'interior d'una proteïna es fixa.
 Les proteïnes s'uneixen a la forma blava per formar un complex proteïna-colorant amb uncoeficient d'extinció més gran que el colorant lliure.
La determinació del contingut proteic d'una mostra requereix la comparació del valor d'absorbància de la mostra amb els obtinguts a partir de quantitatsconegudes de proteïnes, amb els quals es construeix una corba de calibratge: a major quantitat de proteïnes, major color desenvolupat i per tant, major absorbància, és per això que es considera uncromòfor exogen. És un mètode que depèn de la interacció relativament inespecífica entre un colorant hidrofòbic i les proteïnes, pel que és sensible a la presència de contaminants com ara les restes dedetergents i líquids orgànics, ja que les proteïnes poden perdre la seva estabilitat i perdre la seva forma nativa, el que provocaria la pèrdua de la unió entre el cromòfor i la zona hidrofòbica deles proteïnes.
Per determinar la concentració total de proteïna es realitza una recta de calibratge prenent una proteïna patró que generalment és la seroalbúmina bovina.
Es preparen tubs testimonisamb diferents quantitats de proteïna i una altra dissolució anomenada "blanc" que només conté aigua i reactiu Bradford i en els tubs testimonis se'ls manté
constant el reactiu Bradford sent els volumsde tots els tubs iguals.
Un cop preparats els tubs es mesura l'absorbància a cadascun d'ells a una longitud d’onda de 595nm, és calibrat l'equip amb el tub blanc (no conté proteïna) d’aquesta...