Metodo De Kunitz

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS. METODOS DE KUNITZ

Objetivos

* elaborará una curva estandar de la actividad enzimática
* determinará la actividad proteolítica de la bromelaína, de la papaína y otras proteasas.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME

1.- Curva de actividad enzimatica.

Complete la tabla 1.

TABLA 1. ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA TRIPSINATubo | Concentracion de Tripsina (mg/ml) | A280 | A280 corregida |
T1y 1 | 0.04 | 0.191 | 0.0585 | 0.133 |
T2 y 2 | 0.08 | 0.281 | 0.079 | 0.202 |
T3 y 3 | 0.12 | 0.323 | 0.054 | 0.269 |
T4 y 4 | 0.16 | 0.35 | 0.05 | 0.3 |
T5 y 5 | 0.2 | 0.436 | 0.051 | 0.385 |
  | Problemas   |  Problemas |  Problemas | Problemas   |
TI y I |  Bromelaina 1:10 | 0.694 | 0.103 |0.591 |
T2 y II |  Bromelaína 1:20 | 0.476 | 0.096 | 0.38 |
T3 y III |  Papaina | 0.191 | 0.091 | 0.1 |

Construir la curva de actividad enzimatica de tripsina (grafica 1), colocando en el eje de las ordenadas la absorbancia corregida a 280 nm y en el de las absisas la concentración de tripsina (mg/ml)

b) ¿ cuantas unidades trpticas hay por miligramo de tripsina . incluya los calculos.por lo tanto :

3. CURVA DE ACTIVIDAD ENZIMATICA ESPECÍFICA
complete la tabla 2.

TABLA 2. CURVA DE ACTIVIDAD ENZIMATICA ESPECIFICA PARA LA DIGESTION DE CASEINA POR TRIPSINA

TUBO | UNIDADES TRIPTICAS | A280 corregida |
1 | 0.003008 | 0.133 |
2 | 0.006016 | 0.202 |
3 | 0.009024 | 0.269 |
4 | 0.01203 | 0.3 |
5 | 0.01504 | 0.385 |

a) haga el gráfico de actividadenzimatica especifica, colocando en las ordenadas la A280 corregida y en las abscisas las unidades tripticas (grafica 2)

b) indique la actividad especifica, en unidades tripticas por gramo de muestra de la piña, (bromelaína) y el ablandador (papaina ). Incluya los calculos.

PROBLEMAS |
Bromelaína 1:10 | 0.591 |
Bromelaína 1:20 |0.380 |
Papaína | 0.1 |

La ecuación de la recta para la curva de actividad enzimática

por la tanto al interpolar en la grafica las absorbencias corregidas;

ya que nuestra curva esta en UT/mg de muestra tenemos que pasar el resultado a gramos por lo tanto :

contenidos en la bromelaína 1:10

Bromelaina 1:20

PAPAÍNA

4.-Preguntas adicionales
a) defina actividadenzimática y actividad enzimática especifica
Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad enzimatica específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).

b)escriba la clasificacion de las proteasas, en funcion de sumecanismo de accion y diga en que grupo se ubican las determinadas en la practica
a)Serín proteasas : Poseen un residuo de serina en su sitio activo y son inhibidas específicamente por diisopropil-fluorofósforo y otros organofosforados.
5Introducción.
b)Tiol proteasas : Son enzimas que requieren de la presencia de un grupo SH en su sitio activo. Estas son inhibidaspor iones de metales pesados, agentes alquilantes y agentes oxidantes.
c)Proteasas ácidas : Poseen uno o más grupos carboxilo en su sitio activo.
d)Metalo proteasas : Requieren de cationes metálicos divalentes. Son inactivadas en presencia de agentes quelantes y por procesos de diálisis
La tripsina es una serina proteasa
Y la bromelaína y la papaína son cisteína proteasasc) ¿para que se adiciona cisteina en las muestras de piña, y de ablandador? (ver preparación de ractivos)
ya que la bromelína y la papaína contienen en su composición en sus residuos terminales cisteína y al agregar mas de esta se efectua la reacción y poco mas rápido al favorecer la actividad enzimaática

d) ¿cuál es la especificidad de enlace de la tripsina?
La tripsina es una enzima...