Metodo de Kunitz





INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITOLÓGICO



Laboratorio de Métodos de Análisis



Grupo: 5QM1

Alumno
Aguilar López Bruno Alejandro



Sección: 2


PRÁCTICA DE

“DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLITICAS MÉTODO DE KUNITZ”




Profesor
Marco AntonioIntroducción
Las enzimas son macromoléculas que sirven de biocatalizadores para las reacciones que se llevan a cabo dentro de una célula eucariote como procariote.  Las enzimas funcionan disminuyendo la energía de activación (ΔG‡) de una reacción, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reacción. Las enzimas no alteran el balance energético de las reacciones en que intervienen, ni modifican,por lo tanto, el equilibrio de la reacción, pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Una reacción que se produce bajo el control de una enzima, o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho más deprisa que la correspondiente reacción no catalizada. Para llevar a cabo su función las enzimas tienen un sitio activo en donde ingresa el sustrato para formar un complejoenzima sustrato y después tener la enzima y el producto.
Las enzimas se pueden clasificar en:
Liasas
Oxidoreductasas
Isomerasas
Transferasas
Hidrolasas
Isomerasas
Las hidrolasas son enzimas que degradan macromoléculas en sus componentes más sencillos (proteínas a aminoácidos, ácidos nucleicos a nucleótidos, polisacáridos a monosacáridos), una de las hidrolasas más estudiadas son lasproteasas, estas son de gran importancia para la investigación, nutrición y la industria. Científicamente el estudio de las hidrolasas se debe a la gran cantidad que existen de estas debido a que desde microorganismos hasta macroorganismos las contienen y muchas de estas son específicas para hidrolizar en un aminoácido en específico, en el ámbito nutricional se utilizan como ablandadores de carne. Lasenzimas son desnaturalizadas por diferentes factores, la mayor parte de ellos son factores físicos los que provocan la pérdida de su estructura tridimensional, sin embargo existen otros factores que provocan que la enzima pierda su función de catalizar estos son los inhibidores forman enlaces covalentes entre el sitio activo de la enzima haciendo que la enzima quede disfuncional.
Los factores quealteran la acción de las enzimas son:
Temperatura
pH
Concentración de sustrato
Concentración de la enzima
Inhibidores
Fundamento:
El método de kunitz se basa en medir la absorbancia de los aminoácidos aromáticos (280 nm) y así poder determinar la concentración y la actividad enzimática especifica de las enzimas proteolíticas.
Objetivos
Elaborar la curva de la actividad enzimática.Determinar la actividad proteolítica de la bromelaína.
Determinar la actividad proteolítica de la papaína.
Determinar la actividad proteolítica de la tripsina.
Resultados
I. Curva de actividad enzimática

Tabla 1. Actividad enzimática de la tripsina
Tubo
Concentración de tripsina
A280
A280 corregida


Problema
Testigo

T1 y 1
0.04
0.411
0.17
0.241
T2 y 2
0.08
0.504
0.162
0.342T3 y 3
0.12
0.445
0.161
0.284
T4 y 4
0.16
0.953
0.17
0.783
T5 y 5
0.2
1.102
0.172
0.93
Problema
TI y I
Bromelaína 1:10
1.479
0.311
1.168
TII y III
Bromelaína 1:20
1.078
0.24
0.838
TIII y III
Papaína
0.195
0.276
0.081


Figura 1. Curva de la actividad enzimática de la tripsina.

a) ¿Cuántas unidades trípticas hay por miligramo de tripsina?



Hay 0.227375Unidades Trípticas de tripsina por gramo.


II. Curva de actividad enzimática específica

Tabla 2. Cuerva de actividad enzimática específica para la digestión de caseína por tripsina.
Tubo
Unidades Trípticas
A280 corregida
1
0.009095
0.241
2
0.01819
0.342
3
0.027285
0.284
4
0.03638
0.783
5
0.045475
0.93


Figura 2. Grafica de la actividad enzimática específica}

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