metodo de kunitz

Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Determinación de la actividad enzimática proteolítica.
Método de Kunitz


Objetivos:

Elaborar una curva estándar de actividad enzimática
Determinar la actividad proteolítica de la bromelaina, la papaína y otras proteasas

Introducción:

Las enzimas son catalizadores biológicos con funciones selectivas y de graneficiencia. 
Las enzimas tanto de organismos sencillos como complejos, catalizan reacciones de rutas 
metabólicas vitales. Una de sus funciones principales es acelerar dichas reacciones, reduce en gran parte la energía necesaria para efectuar la reacción. Las enzimas son muy específicas para cada  sustrato sobre el cual actúan y su grado de especificidad varia dependiendo de ello. Las enzimasproteolíticas son responsables de la coagulación de la sangre. Hay enzimas proteolíticas en las células fagocíticas de la sangre que se encargan de hidrolizar las proteínas extrañas. Las enzimas proteolíticas pertenecen a uno de los más importante grupos de enzimas  en el proceso industrial de alimentos. Son usadas en la producción de quesos, ablandamiento de carne y la 
modificación depropiedades de las proteínas de cereales en el pan y para la manufactura de cereales. La reacción de catálisis mas común realizada por estas enzimas es la hidrólisis de enlaces peptídicos de una proteína.
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: Una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posiblepero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasassignificativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. Las enzimas proteolíticas o proteasas son un grupo de enzimas que descompone en unidades mas pequeñas las proteínas.
Estas rompen la cadena larga de moléculas que forman las proteínas formando fragmentos más cortos llamados péptidos que son moléculas formadas por aminoácidos. Están presentes en bacterias yplantas pero son más abundandantes en los animales. Las enzimas proteolíticas o proteasas se denominan también proteinasas.
Las proteasas se producen de manera natural en el organismo y constituyen entre el 1% y el 5% del contenido genético. Estas enzimas juegan en la descomposición de largas cadenas proteicas en fragmentos cortos partiendo el enlace peptídico que une dos aminoácidos, así como tambiéndeterminan el tiempo de vida de otras proteínas que juegan un papel fisiológico importante como son las hormonas, los anticuerpos u otras enzimas

RESULTADOS
tubo
Concentracion de tripsina (mg/mL)
A280
A280 corregida


problema
testigo

T1 Y 1
0.04
0.139
0.044
0.095
T2 Y 2
0.08
0.252
0.047
0.205
T3 Y 3
0.12
0.325
0.061
0.264
T4 Y 4
0.16
0.408
0.062
0.346
T5 Y 50.20
0.476
0.076
0.400
PROBLEMAS
TI Y I
BROMELAINA 1:10
0.568
0.204
.364
TII Y II
BROMELAINA 1:20
0.215
0.109
.106
TIII Y III
PAPAINA
0.077
0.062
.015

Tabla 1. Datos de absorbancia obtenidas y corregidas a partir del tratamiento de degradación enzimática de Hemoglobina usando diferentes enzimas.



Figura 1. Curva de actividad enzimática de la Tripsina

Calculo de [UT][UT] =
1.87/20 =
0.0935

Calculo de UT por mg de Tripsina.




Tubo
Unidades Tripticas
A280 Corregida
1
0.00374
0.095
2
0.00748
0.205
3
0.01122
0.264
4
0.01496
0.346
5
0.01870
0.400

Tabla 2. Datos de la curva de actividad enzimática específica para digestión de caseína por tripsina.



Figura 2. Curva de actividad enzimática específica

Enzima
Unidades...