metodo de kunitz






Objetivos:
Elaborar una curva estándar de actividad enzimática.
Determinar la actividad proteolítica de la bromelaína, de la papaína y otras proteasas.

Fundamento:
El método deKunitz se basa en medir la cantidad de péptidos y aminoácidos solubles liberados durante la hidrólisis de una proteína, catalizada por una enzima proteolítica, aprovechando la capacidad de los productosde reacción de absorber selectivamente a 280nm. La actividad proteolítica es proporcional a la cantidad de aminoácidos y péptidos liberados durante la reacción de hidrólisis.

Datos experimentales einforme:
1. Curva de actividad enzimática.
Tabla 1. Actividad enzimática de la tripsina.
Tubo.
Concentración de Tripsina (mg/mL)
A a 280 nm
A a 280 nm corregida


Problema
Testigo

T1 y1
0.04
0.259
0.077
0.182
T2 y 2
0.08
0.394
0.059
0.335
T3 y 3
0.12
0.490
0.069
0.421
T4 y 4
0.16
0.642
0.073
0.569
T5 y 5
0.20
0.672
0.060
0.612
Problemas
TI y I
Bromelaína1:10
0.708
0.221
0.487
TII y II
Bromelaína 1:20
0.519
0.165
0.354
*TIII y III
Papaína 1:2
0.445
0.310
0.145
*TIV y IV
Papaina 1:5
0.179
0.140
0.039



¿Cuántas unidades trípticashay por miligramo de tripsina? Incluya los cálculos.

2. Curva de actividad enzimática específica.
Tabla 2. Curva de actividad enzimática específica para la digestión de caseína por tripsina.Tubo.
Unidades Trípticas.
A a 280 nm corregida.
1
0.000547
0.133
2
0.01094
0.273
3
0.01641
0.358
4
0.02188
0.435
5
0.02735
0.522




Indique la actividad específica, en unidadestrípticas por gramo de muestra, de la piña (bromelaína). Incluya los cálculos.
Para la bromelaína 1:10
Interpolando el valor de absorbancia a 280 nm corregida en la curva de actividad enzimáticaespecífica, se tiene:

Multiplicando por el factor de dilución:

Como se obtuvo un volumen final de extracto de 36 mL por 25 g de piña, entonces:

Para la bromelaína 1:20
Interpolando el valor...