Metodo De Lowry Para Proteinas

TRABAJO PRACTICO N° 1 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS. OBJETIVO. • Realizar curvas de calibración a partir de una muestra de proteínas (albúmina bovina), con distintas concentraciones conocidas, utilizando el método de Bradford y Lowry estándar, con HEPES y TCA. • Hallar la concentración de proteínas en dos muestras incógnita: una sin interferentes y otra con el interferente HEPES. INTRODUCCIÓN. Elmétodo de Lowry se aplica para hallar la concentración de proteínas en las muestras. Este método utiliza una solución, scn 1, que contiene cobre (aumenta la sensibilidad en la determinación de proteínas) y un reactivo, llamado Reactivo de Folin, que se reduce en presencia de proteínas. Las especies reducidas cambian su color hacia el azul y son capaces de ser leídas por el espectrofotómetro paraaveriguar su absorbancia. Si las concentraciones de las proteínas son conocidas, se realiza la curva estándar de calibración (Absorbancia vs. Concentración). Si, en cambio, las concentraciones de las muestras no son conocidas, se mide su absorbancia, se interpola este valor con la curva de calibración y así se halla la concentración de la muestra incógnita. A la muestra se le puede agregar HEPES,interferente, y luego tratarla con TCA, para precipitar la proteína. Se hallan nuevas curvas y se las puede comparar con la estándar. El método de Bradford, que tiene las mismas aplicaciones que el de Lowry, utiliza un reactivo, llamado reactivo de Bradford, que al entrar en contacto con proteínas se reduce, virando su color del amarillento al azul intenso. Las muestras son leídas a 595nm y conestos datos se realiza la curva de calibración. PROCEDIMIENTO. • Bradford Std. Se tomaron 5 tubos de vidrio en los que se colocaron distintas cantidades de solución de BSA (albúmina sero bovina) 1mg/ml y luego se llevaron los tubos al mismo volumen final (100 ul) con agua destilada. Se agregaron 1000 ul de reactivo de Bradford, se dejó reaccionar dos minutos y se midió la absorbancia de cada tuboen el espectrofotómetro a 595 nm de h. Se realizó la curva de calibración con los valores obtenidos, se hizo la regresión lineal y se calculó el ajuste de la recta. Tubo 0 1 2 3 4 5 Cant. BSA [ug] 0 1 5 10 20 40 Volumen agua [ul] 100 99 95 90 80 60 Volumen final [ul] 100 100 100 100 100 100 Reactivo de Bradford [ul] 1000 1000 1000 1000 1000 1000

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• Lowry STD. Se tomaron 7 tubos de vidriocon distintas cantidades de scn. de BSA y se llevaron al mismo volumen final (300 ul) con agua destilada. A cada tubo se lo incubó primero durante 10 minutos con la solución 1 y luego se agregó el reactivo de Folin (150 ul), se agitó y se incubó durante 30 minutos. Finalmente se midió la absorbancia de cada tubo en el espectrofotómetro a 660 nm, se realizó la curva de calibración y se calculó elajuste de la recta. • Lowry HEPES. Se tomaron 7 tubos con diferentes cantidades de scn. BSA. Se llevaron al mismo volumen final (300ul) con HEPES (interferente), luego se incubó 10 minutos con scn. 1 y finalmente 30 minutos con el reactivo de Folin (150 ul). Se midieron las absorbancias en el espectrofotómetro a 660 nm y se realizó con estos valores la curva de calibración. Tubo 0 1 2 3 4 5 6Cantidad BSA [ug] 0 1 5 10 25 50 75 Volumen HEPES [ul] 300 299 295 290 275 250 225 Volumen final [ul] 300 300 300 300 300 300 300 Vol. Scn. 1 [ul] 1500 1500 1500 1500 1500 1500 1500 Vol. Reactivo de Folin [ul] 150 150 150 150 150 150 150

• Lowry TCA. Se tomaron 7 tubos a los que se agregaron diferentes cantidades de scn. BSA y se llevaron al mismo volumen final con agua destilada (300 ul). A cadatubo se agregó HEPES y la misma cantidad de TCA. El TCA se agrega para que precipite la proteína y así poder separarla del interferente. Se dejó a los tubos así preparados durante 15 minutos en frío para favorecer la precipitación. Luego se centrifugaron (15 minutos− 3500 r.p.m.), se descartó el sobrenadante por inversión sobre papel absorbente, se agregó éter etílico para descartar el TCA, se...