Metodo de sanger


PRACTICA N° 1
Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre. Método de Sanger.
INTRODUCCIÓN
Este método consiste en la degradación repetitiva de los péptidos a partir de unareacción con el grupo amino terminal libre y con fenil-isotiocianato (PITC) en condiciones alcalinas suaves formando feniltiocarbamilo, el producto es entonces tratado con ácido fluorhídrico paraliberar el aminoácido que ha reaccionado del resto de la cadena peptídica mediante la formación de un derivado de tiazolinona, el cual es convertido a un derivado más estable (un aminoácido PHT) por laadición de TFA. Como consecuencia el péptido tiene ahora un nuevo residuo amino terminal listo para repetir el ciclo. La identificación de los PHT-aminoácidos es usualmente llevada a cabo por RP-HPLC.Los péptidos que ya han sido liberados de la columna y que son analizados por esta metodología no presentan ninguna consideración especial, no así cuando el péptido analizado aun se encuentra adheridoa la columna. Debido a que este método requiere del grupo amino libre, los grupos protectores utilizados en la síntesis para proteger al α-amino deben ser removidos o de otra forma no será posibleanalizar el péptido sintetizado mediante la degradación de Edman. Con respecto a los grupos protectores de las cadenas laterales, éstas sólo tendrán un efecto durante la identificación del aminoácido,ya que los grupos protectores tienden a hacer las cadenas laterales más hidrofóbicas; por la tanto el gradiente utilizado para eluir los PTH-aminoácidos en RP-HPLC deben extenderse, aunque esto nosucede si tales grupos protectores son derivados de Boc, pues los aminoácidos serán desprotegidos por el uso de TFA durante la fase final .Los residuos de cisteína no pueden ser detectados por estemétodo a menos que sean modificados, usualmente se utiliza acrilamida o bromo propilamina para derivatizarlos. Cuando el análisis es hecho en la resina, estos residuos pueden ser muy problemáticos, pues...