METODO DE SANGER
Páginas: 2 (263 palabras)
Publicado: 2 de febrero de 2016
5’ GAATTGGCGGGCTA’.
El método dideoxi de secuenciación ideado por Sanger está basado en el empleo de didesoxinucleótidos que carecen de uno de los gruposhidroxilo, de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, está cadena no puede continuar elongándose ya que la ADNpolimerasa necesita un extremo 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el desosinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo.
Se aísla y se clona el ADNque se desea secuenciar, este ADN se desnaturaliza y se emplea una sola hélice en la secuenciación. En la secuenciación se utiliza un cebador o “primer” marcadoradiactivamente que suministra el extremo 3’OH que necesita la ADN polimerasa. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el ADN molde de hélice sencilla quese desea secuenciar, con ADN polimerasa, con el cebador marcado y con los cuatro nucleótidos trifosfato. A cada tubo se le añade una pequeña proporción de undidesoxinucleótido trifosfato , un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos se producirán cadenas deADN de distintas longitudes, terminando todas en el lugar en el que se incorporó el dideoxi correspondiente añadido al tubo.
Posteriormente, estas piezas de ADN seseparan mediante electroforesis vertical en geles de acrilamida. Las piezas más pequeñas migran más rápidamente que las grandes y la secuencia se puede leerdirectamente sobre el gel de acrilamida.
En el siguiente esquema se indican los resultados que obtendríamos al realizar la autorradiografía del gel de secuenciación :
5’ GAATTGGCGGGCTA’.
El método dideoxi de secuenciación ideado por Sanger está basado en el empleo de didesoxinucleótidos que carecen de uno de los gruposhidroxilo, de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, está cadena no puede continuar elongándose ya que la ADNpolimerasa necesita un extremo 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el desosinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo.
Se aísla y se clona el ADNque se desea secuenciar, este ADN se desnaturaliza y se emplea una sola hélice en la secuenciación. En la secuenciación se utiliza un cebador o “primer” marcadoradiactivamente que suministra el extremo 3’OH que necesita la ADN polimerasa. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el ADN molde de hélice sencilla quese desea secuenciar, con ADN polimerasa, con el cebador marcado y con los cuatro nucleótidos trifosfato. A cada tubo se le añade una pequeña proporción de undidesoxinucleótido trifosfato , un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos se producirán cadenas deADN de distintas longitudes, terminando todas en el lugar en el que se incorporó el dideoxi correspondiente añadido al tubo.
Posteriormente, estas piezas de ADN seseparan mediante electroforesis vertical en geles de acrilamida. Las piezas más pequeñas migran más rápidamente que las grandes y la secuencia se puede leerdirectamente sobre el gel de acrilamida.
En el siguiente esquema se indican los resultados que obtendríamos al realizar la autorradiografía del gel de secuenciación :
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.