Metodo Insectos Chelex

Protocolo de extracción de ADN para artrópodos utilizando resina Chelex-100 (BIO-RAD)

Extracción de ADN
La extracción de ADN de artrópodos se lleva a cabo utilizando la resina quelante Chelex-100Bio Rad (Fig. 1,) basada en el artículo de Casquet, et al. (2012).
Fig. 1. Presentación de 100g de la resina quelante Chelex-100 de Bio Rad.

Materiales y método
Para la elaboración de 14.4 mL desolución Chelex-100 al 10%, se disuelve utilizando un agitador magnético, 1.4 g de resina Chelex (Bio Rad) en 14.4 mL de agua destilada.


Utilizando pinzas de relojero estériles, se colocaron de 1 a 2patas del especímen en el fondo de un tubo eppendorf de 0.2 mL; en caso de que el especimen tuviera una longitud máxima de 2 mm, se utilizó todo el individuo. Se reposaron las muestras a temperaturaambiente durante 30 min para favorecer la evaporación del etanol donde se encontraban las muestras. Se adicionaron 10 L de Proteinasa K (20 mg/mL Thermo Scientific) a cada tubo y 150 L de la soluciónChelex-100 al 10%, procurando que esta se mantuviera en el agitador magnético para mantener la homogeneidad de la solución.
Se incuban las muestras durante una noche completa (entre 9 y 10 horas)dentro de una estufa a 55C. Transcurrido ese tiempo, se realizó el método para amplificación, en su defecto, las muestras se almacenaron a una temperatura de 20C.

Amplificación de la región COI delADN
Las amplificaciones a partir de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se llevaron a cabo en un volumen final de 25µl, con los siguientes reactivos:
Reactivo
Concentración inicial
Concentraciónfinal
Cantidad para un tubo
Cantidad para 10 tubos
dNTPs
20mM
1.25mM
0.5μl
5 μl
Cloruro de Magnesio (Promega)
25mM
1.25mM
2.5μl
25 μl
Oligo forward
10 pM
1.25pM
0.5μl
5 μl
Oligo Reverse
10pM
1.25pM0.5μl
5 μl
Taq (Promega)
5U/μl
0.05 μl
0.2μl
2μl
Buffer 5x Colorless
(GoTaq Promega)
10x
0.25X
5μl
50μl
Agua ddH2O (Gibco)
--
--
12.8μl
1280μl
ADN (agregar después de dividir el mix)


3μl*

*Se...