Metodologia para purificar proteasas

Realización de la curva patrón
La actividad enzimática se evaluara por medio de dos métodos, el método de Kunitz el cual consta de una muestra y un testigo con el fin de descartar la hidrólisis dela caseína por calentamiento y el método de Lowry, para valorar cuantitativamente proteínas.

Inicialmente, se prepara una solución de caseína al 1% (p/v), disuelta en buffer de fosfatos pH 6.0, 50mM con agitación constante y ebullición durante 10 minutos, de igual manera ácido Tricloro Acético (TCA) a 0.4M. (Pandey, 2005; Gandolfi y Peralta, 2006).
Para la realizar la muestra y el testigo,se adiciona para cada uno en tubos de ensayo, 500 μL de caseína previamente incubada a una temperatura de 30°C por un tiempo de 10 minutos y a su vez se añade 500 μL de extracto crudo enzimático(diluido 1:10 con buffer de fosfatos pH 7.0). Dichas mezclas se dejan actuar por un lapso de 10 minutos en un baño de temperatura controlada a 30°C. Para detener la reacción producida por estas mezclasse adiciona a los tubos 1 mL de TCA con agitación. Posteriormente se lleva a centrífugar a 19,100 G durante 10 minutos. (Alquicira, 2005)

Al finalizar el método de Kunitz se realiza el método deLowry para la muestra y el testigo. Este experimento se realiza en un tubo de ensayo al cual se adiciona 500 μL del sobrenadante de la muestra con 2.5 mL de Na2CO3 0.4N y se añade 500 μL de reactivo deFolin (1:5 en agua destilada), enseguida se deja reaccionar en un baño de temperatura controlada a 30 °C durante un tiempo de 30 minutos. Después, la absorbancia debe ser medida a 660 nm en cada unode los tubos de ensayo tanto para la muestra como para el testigo. Finalmente, se realiza una curva patrón de tirosina con un volumen final de 18,1 mg/l, en 6 tubos de ensayo a diferentesconcentraciones de tirosina. A cada uno de los tubos se adiciona 5 mL de una solución de Na2CO3 0.4N y 1 mL de reactivo de Folin, esto se deja reaccionar en un baño de temperatura controlada a 30 °C durante un...