Metodologia

Laboratorio de Evolución - Facultad de Ciencias

EXTRACCION DE ADN
Soluciones necesarias: Buffer de lisis (50 mM de Tris HCl, 50 mM EDTA ph 8, 1 % de SDS y 50 mM de NaCl), Proteinasa K (10 mg/ml), NaCl ( 5 M), TE 1X ph. 8 (autoclavado), Etanol o isopropanol absolutos a -20 ºC y opcionalmente RNasa A (10 mg/ml). 1. Colocar una pequeña muestra de tejido (unos 20 mg) en un Eppendorf de 1.5 o 2ml. 2. Opcional: Enjuagar brevemente con agua destilada. 3. Agregar 500 ul de buffer de lisis y 10 ul de proteinasa K. 4. Incubar a 55ºC, preferentemente con agitación, por un mínimo de 2 horas o hasta toda la noche. 5. Opcional: una hora antes de finalizar, agregar 5 ul de RNasa A. 6. Centrifugar al máximo (por ej., 15.000 rpm) por 15 min. 7. Pipetear 500 ul del sobrenadante a un tubo limpio.Evitar acarrear la fracción sólida del fondo, así como la capa superficial oleosa (si existiese). 8. Agregar 300 ul de cloruro de sodio, agitar brevemente y centrifugar al máximo por 15 min. 9. Pipetear 500-600 ul del sobrenadante a un tubo limpio. Agregar igual volumen de isopropanol a -20ºC o el doble de volumen de etanol a -20ºC. Agitar lentamente primero, luego mezclar completamente. 10. Opcional:para recuperar mayor cantidad de ADN, colocar a -20ºC por dos horas o toda la noche. 11. Centrifugar al máximo por 15 min. Descartar todo el líquido sobrenadante con cuidado de no tirar el pellet. 12. Lavar breve y cuidadosamente con unos 750 ul de etanol 70º , evitando perder o disgregar el pellet. 13. Descartar el alcohol. Secar en estufa a 37ºC (lleva unas dos horas). 14. Resuspender en 100 ul1xTE. Agitar, y opcionalmente incubar a 55ºC por 2 horas (o menos). 15. Guardar a -20ºC.

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Notas:
- Para PCR se utliliza una dilución a 4 ug/ml, para lo que debe medirse la concentración del ADN en espectrofotómetro. También puede hacerse una dilución 1:100 o 1:1000 y sólo preocuparse de medir la concentración si el PCR no funciona. - Si unpellet se disgrega involuntariamente en cualquier etapa, se repite la centrifugación.

Electroforesis de los productos de PCR
MINIGELES
Preparación: • Se limpian bien las placas de vidrio con etanol 95 %, y se colocan los espaciadores de 0.8 mm entre ellos, sujetando los extremos con pinzas. • Se mezclan 10 ul de la solución de acrilamida 5% (sin urea) con 10 ul de TEMED y 100ul de APS. Se agitabrevemente la mezcla y se coloca entre los dos vidrios. • Rápidamente se coloca el peine de 0.8 mm en el extremo, y se deja polimerizar por unos 20 minutos. • Una vez polimerizado, se limpia bien y se coloca en el aparato de electroforesis, el cual se rellena con Buffer TBE 1X.

Electroforesis:

• • •

Se mezclan 5 ul de producto de PCR y 2ul de "Loading buffer" Se cargan en los pocillos delminigel, y en el último se coloca el estándar de tamaño (100pb generalmente). Se corren los productos a 150V por 25 minutos.

GELES DE POLIACRILAMIDA DESNATURALIZANTE
Este gel se prepara a partir de un stock de acrilamida 7% desnaturalizante (la misma acrilamida utilizada para secuenciación), que tiene la siguiente composición:

Stock acrilamida 19:1 (acrilamida/bisacilamida) Urea TBE 5XAgua destida

36 ml 84 g 24 ml hasta completar 200ml

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Preparación del gel: • Se limpian bien las placas de vidrio con Etanol 95%, y luego se impregnan las caras interiores con una pequeña cantidad de SDS al 10% (se extiende bien con un papel para que quede una delgada capa). • Se colocan los espaciadores de 0.8 mm entre ambos vidrios en 2 de loslados (las gomas deben estar bien justas sobre la placa menor), y se sujeta todo con pinzas. • Se mezclan 60 ml del stock de acrilamida anterior con 100 ul de TEMED y 200ul de APS. • Se agita brevemente y se vuelca lentamente la mezcla entre los dos vidrios, inclinando levemente los mismos. • Una vez lleno se vuelve a la posición horizontal y se coloca el peine invertido. Se deja polimerizar....