Metodos De Estudio De Membrana

Métodos de estudio de membrana
1.- Microscopia electrónica de fractura por congelación
En esta técnica, se corta con un micrótomo una membrana congelada rápidamente (un micrótomo es un instrumento que se utiliza para realizar cortes fines de especímenes biológicos para su estudio en el microscopio). La membrana suele separase a lo largo de las superficies internas de las dos capas lipídicas.Para prepararlas para su observación con el microscopio electrónico, las delicadas superficies internas se sombrean con una capa fina de un metal pesado (normalmente platino. En las membranas facturadas por congelación se suelen observar numerosas partículas intramembranosas.
En el caso de la microscopía óptica las muestras deben tener un grosor de 5-8 μm aproximadamente, y para microscopíaelectrónica, valores entre 20 y 40 nm. Es necesario, por tanto, cortar el material que ha de ser estudiado en "rodajas" muy finas.
La preparación del material biológico muerto, para su estudio al microscopio óptico o al electrónico, consta de cuatro pasos fundamentales: fijación, inclusión, corte y tinción.
2.- Recuperación fluorescente tras fotodesaparición
Se utiliza para observar la difusiónlateral. Las membranas plasmáticas celulares están marcadas de forma uniforme con un marcador fluorescente. Utilizando un rayo láser se destruye la fluorescencia (o se hace “desaparecer”) de un área pequeña. Utilizando una cámara de vídeo, puede rastrearse en función del tiempo el movimiento lateral de los componentes de la membrana dentro y fuera del área que se ha hecho desaparecer.
3.-Electroforesis en gel del poliacrilamida con SDS
Es una variante de la electroforesis, muy utilizada para determinar el peso molecular, emplea el detergente con carga negativa docecil sulfato sódico (SDS). En esta técnica el detergente se une a las regiones hidrófobas de las moléculas proteicas. Como resultado de la unión de las moléculas de SDS, las proteínas se desnaturalizan y adquieren formas devarilla.
Este efecto se consigue también añadiendo marcaptoetanol que rompe los pares de disulfuro.
Debido a que la mayoría de las moléculas se unen al SDS con una relación aproximadamente proporcional a sus pesos moleculares, durante la electroforesis, las proteínas tratadas con SDS migran hacía el ánodo (polo +)sólo en relación con su peso molecular debido a los efectos de filtración en gel.Las estimaciones del peso molecular pueden también obtenerse utilizando las ultracentrifugación. Recuerde que la ultracentrifugación separa los componentes de acuerdo con su tamaño, área superficial y densidad relativa. Utilizando fuerzas centrífugas elevadas pueden determinarse las masas moleculares de las macromoléculas como las proteínas. Utilizando una ultracentrífuga analítica, se mideópticamente la velocidad a la que sedimentan estas moléculas debido a la influencia de la fuerza centrífuga.

4.- Cristalografía de rayos X
En ésta técnica se exponen especímenes cristalinos muy ordenados a un haz de rayos X. Al golpear los rayos X el cristal, son dispersados por los átomos del cristal. El patrón de difracción a que da lugar se registra sobre una placa fotográfica. Los patrones dedifracción se utilizan para construir un mapa de densidad electrónica. Debido a que no hay lentes objetivo para recombinar los rayos X difractados, la imagen tridimensional se reconstruyen matemáticamente. Los programas de ordenador realizan ahora estos cálculos extremadamente complejos y laboriosos.
Se puede incluir iones o moléculas en el comportamiento acuoso de las vesículas lipídicasformándolas en presencia de dichas sustancias.

5.- Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS
En ésta técnica la membrana que ha de analizarse se solubiliza primero en una disolución de una molécula anfipática, dodecilsulfato sódico al 1%.
Este detergente desorganiza la mayor parte de las interacciones proteína-proteína y proteína-lípido. Esta disolución se coloca en el extremo de...