Metodos de secuenciación

Sistema de Secuenciación Masiva
El análisis consiste en averiguar la secuencia de las moléculas orgánicas conocidas como nucleótidos del ADN (ácido desoxirribonucleico). La secuencia de ADN es la información genética que se hereda, de manera que descifrarla es clave para poder estudiar enfermedades o desarrollar utilidades biotecnológicas a partir de microorganismos.
En la actualidad existentres tecnologías de secuenciación de última generación: Solexa de Illumina, SOLiD de ABI y 454 de Roche. Las tres están basadas en tecnologías diferentes. Con las dos primeras se obtiene un gran número de secuencias, pero de tamaño muy corto, entre 50 y 150 nucleótidos; mientras que el 454 de Roche analiza fragmentos de ADN más largos, de manera que es el único que obtiene secuencias de entre 450 y550 nucleótidos, con lo cual la información que se obtiene sobre el genoma es mucho más fiable, con menos errores, aunque proporcione menos cantidad de secuencias.
El genoma se secuencia por partes, ya que sólo se pueden leer fragmentos cortos de ADN. Por eso, la tarea de los científicos es fragmentar el genoma, secuenciarlo con ayuda de la tecnología y reconstruirlo para tener la secuenciacompleta. Al comienzo del proceso, el ADN se fragmenta de forma aleatoria y es sometido a varias operaciones de preparación hasta que queda listo para que la máquina pueda leerlo. Cada uno de los fragmentos va unido a una bolita y todos ellos son depositados en una placa que lleva un millón de 'microagujeros'. Cada uno de estos huecos sólo permite la incorporación de una de las bolitas. Una vez en lamáquina, se realiza un análisis de imagen. Cada vez que se produce la lectura de un nucleótido, se emite una señal fluorescente que es captada por la máquina, se pasa al siguiente nucleótido y así sucesivamente. Después, potentes ordenadores procesan la información y la traducen a las letras A, C, G y T (correspondientes a los nucleótidos adenina, citosina, guanina y timina), que ensamblan paraobtener toda la información genética.
Esta tecnología es importante en la investigación en cáncer para secuenciar los genomas de distintos tipos de tumores con el fin de identificar qué genes tienen un papel importante en cada uno de ellos y poder desarrollar fármacos que actúen sobre dichos genes para paliar o evitar la progresión tumoral.
Por otra parte, científicos de todo el mundo tratan desecuenciar los genomas microbianos que puedan tener tanto interés biomédico como interés industrial.

FUNDAMENTOS DE:
PCR
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y dejar que vuelvan aunirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. Se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas. Todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción.
Southern blot
Es unatécnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas. Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada (sonicación ó enzimas de restricción). Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vezterminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan aun filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon. El filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de...