Mi Vida

METODOS DE SEPARACION DE PROTEINAS

KARLUISGONZALEZ MORELO
VICTORIA PACHECO


UNIVRSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE INGENIERIAS
PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS
BERASTEGUI CORDOBA
2012

METODOS DE SEPARACION DE PROTEINAS
La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la purificación, al Menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmenteun gran esfuerzo ya que una célula contiene miles de sustancias diferentes, la molécula que buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy bajas.
El primer paso en el aislamiento de una proteína es la rotura celular, para posteriormente poder extraer la proteína con un tampón adecuado. El método de rotura a elegir depende de las características mecánicas deltejido o células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los distintos métodos ellos están:
* LISIS CELULAR. Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferenciaosmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura.
* DESTRUCCIÓN MÉCANICA. Entre estos métodos se encuentran La homogenización (hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad através de un pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).
* CONGELACIÓN-DESCONGELACIÓN. La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 ºC). Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizantampones de extracción para solubilizar las proteínas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones específicos para proteínas solubles o bien que contengan además detergentes si se pretende purificar proteínas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice.
Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural esta expuesta amuchos agentes que pueden dañarla. Los cambios bruscos de pH, ácidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la acción de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos) son los principales factores que pueden desnaturalizar las proteínas. Para evitar o minimizar estos factores la manipulación de las proteínas durante el proceso de purificación suele llevarse a cabo endisoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4ºC) y se procura que el proceso sea lo más corto posible, además en ocasiones es necesario añadir el tampón de extracción agentes protectores de grupos funcionales específicos de la proteína o bien inhibidores de proteasas.
El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que
Contiene una mezcla de enzimas, membranas y células rotas.Esta preparación se somete a centrifugación (10.000 – 15.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las proteínas solubles, del precipitado que además de restos celulares también contienen proteínas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente)constituye el extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés objeto de la purificación. A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrífuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores estén fijos.
Para purificar una proteína es imprescindible tener un método para detectar cuantitativamente su presencia. Es deseable que este método sea...