Micaela Elizabeth Gonzalez ProteínasIII

Trabajo Práctico Nº3

Electroforesis en geles de poliacrilamida










Nombre y apellido: Micaela Elizabeth Gonzalez
Comisión: 03
Alacena: 03




















Objetivo
Estimar el peso molecular de polipéptidos y proteínas y evaluar la presencia de puentes disulfuro en los mismos.

Materiales y métodos
Según Guía de Trabajos Prácticos de Química Biológica 2014.

Resultados

Tabla I:Reactivos para preparar 2 geles de poliacrilamida


Concentración final de archilamida/bisacrilamida

Gel Running 10% (ml)
Gel Stacking 4% (ml)
Agua
4,00
3,00
Tris/HCl 1,5 M pH 8,8
2,5
-
Tris/HCl 0,5 M pH 6,8
-
1,25
SDS 10% (p/v)
0,1
0,05
Archilamida/bisacrilamida 30%
3,3
0,65

Persulfato de amonio 10% (p/v)
0,1
0,035
TEMED
0,01
0,008
Volumen total
10,00
5,00

Tabla II: Gel 1

Calle
Muestra
Volúmen asembrar
1
Patrones de peso molecular
10 l
2
Ovoalbúmina con β-ME (OVO +)
15 l
3
Ovoalbúmina con β-ME (OVO +)
15 l
4
Ovoalbúmina sin β-ME (OVO -)
15 l
5
Ovoalbúmina sin β-ME (OVO -)
15 l
6
-globulina sin β-ME ( -)
15 l
7
-globulina sin β-ME ( -)
15 l
8
-globulina con β-ME ( +)
15 l
9
-globulina con β-ME ( +)
15 l
10
Patrones de peso molecular
10 l

Tabla III: Gel I. PM y Rf de lasmuestras y los patrones

Calles: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10



PM (Da)
Log PM
Distancia recorrida (cm)
Rf
Miosina
200.000
5,30
0,4
0,066
Β-Galactosidasa
116.000
5,06
1,00
0,17
Fosforilasa B
97.000
4,99
1,20
0,20
Seroalbúmina Bovina
66.000
4,82
1,70
0,28
Ovoalbúmina
45.000
4,65
2,70
0,45
Anhidrasa Carbónica
31.000
4,49
4,00
0,67
Inhibidor de Tripsina
25.000
4,405,40
0,90
Ovoalbúmina Muestra (+)
46.773
4,67
2,70
0,45
Ovoalbúmina Muestra (-)
41.686
4,62
3,20
0,53
-globulina Muestra (+)
53.703
33.884
4,73
4,53
2,20
4,00
0,37
0,66
-globulina Muestra (-)
-
-
-
-
0
Frente de corrida: 6,00 cm

PM Ovoalbúmina con β-ME: una cadena de 47.242
PM -globulina con β-ME: 2 cadenas pesadas de 54.330 y 2 cadenas livianas de 34.092

Presencia de puentes disulfuro:Ovoalbúmina= P. Intracatenario
-globulina= P. Intercatenarios

Tabla IV: Gel II. Análisis semi-cuantitativo de las muestras de Ovoalbúmina A, B, C y D (del Trabajo Práctico I de Proteínas). IOD y masas de las muestras A, B, C y D

Se siembran 15 µl de solución de OVA diluida al 1/10.
Calle 1: Patrones de PM
Calles 2 y 3: OVO A (1,5 mg/ml)
Calles 4 y 5: OVO B (2,0 mg/ml)
Calles 6 y 7: OVOC (2,5 mg/ml)
Calles 8 y 9: OVO D (3,0 mg/ml)

Calles: 1 2 3 4 5 6 7 8 9



OVO A
OVO A
OVO B
OVO B
OVO C
OVO C
OVO D
OVO D
Calle
2
3
4
5
6
7
8
9
Masa (g)
2,25
2,25
3,00
3,00
3,75
3,75
4,50
4,50
IOD
125
130
181
179
230
220
320
340








Gráfico I


log PM = -0,6746.Rf + 4,9779
R2 = 0,964
Descartados los puntos: (0,066; 5,30), (0,17; 5,06) y(0,20; 4,99)

Grafico II

IOD = 65 ug-1 x masa - 17,5
R2 = 0,9913


Conclusiones

En este Trabajo Práctico se pudieron calcular los distintos pesos moleculares de las muestras corridas con β-ME. Se observó que a mayor peso molecular, menor es la distancia recorrida.
La gamma-globulina es el polipéptido más grande, y tiene 2 cadenas pesadas y 2 cadenas livianas de distinto peso molecular, unidas porpuentes disulfuro intercatenarios. Esto se pudo evidenciar al obtenerse dos bandas distintas en las calles 8 y 9 con el agente reductor. En la calle 6 se puede visualizar una sola banda, bien intensa, debido a que no se rompieron los puentes disulfuro que mantienen unidas a las cadenas livianas y pesadas de la proteina, en la calle 7 (sin β-ME), 8 y 9 se observan dos bandas. Esto se puede deber aque se sembraron mal las muestras correspondientes a la -globulina con y sin β-ME, generándose una difusión de la muestra sin β-ME, y por lo tanto se visualizan dos bandas en la calle 7, cuando en realidad debería verse una sola (debido a la no ruptura de los puentes disulfuro).
En las calles 8 y 9, las bandas que corrieron menos correspondían a las cadenas pesadas, y las que corrieron más, a las...