micologia

Universidad Central de Venezuela
Facultad de Ciencias
Postgrado en Biología Celular
Tesis Doctoral

BIOCONTROL DE Rhizoctonia solani
KÜHN POR Trichoderma spp.

Trabajo presentado por el
MSc. Domenico Fabio Pavone Maniscalco
ante la Ilustre Universidad Central de Venezuela
como requisito para obtener el Título de
Doctor en Ciencias Mención Biología Celular.

Tutor: Dr. Blas DortaMarzo de 2012.

INDICE GENERAL
Página
RESUMEN ……………………………………………………………………..

2

ABSTRACT……………………………………………………………………..

3

1.- Introducción general…..…………………………………………….

4

2.- Objetivo general del trabajo ………………………………………

7

CAPITULO 1. Biodiversidad de Trichoderma spp en
campos de maíz ……………………………………………………………..

9

1.1.- Introducción …………………………………………………………..

91.1.1.-Identificación de especies de Trichoderma spp …. 9
1.1.2.- Identificación molecular…………………………………. 12
1.1.3.- Identificación morfológica ……………………………… 14
1.1.4.- Diversidad de Trichoderma spp ……………………….
1.2.- Objetivos ……………………………………………………………….. 18
1.3.- Materiales y métodos ….…………………………………………… 19
1.3.1.- Obtención de muestras de suelo …………………….. 19
1.3.2.- Aislamiento de cepas fúngicas……………………….. 19
1.3.3.- Cultivos monospóricos …………………………………… 19
1.3.4.- Identificación de los aislados …………………………. 21
1.3.5.- Extracción de DNA ………………………………………… 21
1.3.6.- Amplificación de las regiones ITS1 e ITS2 del
rDNA y tef1 …………………………………………………………….. 21
1.3.7.- Secuenciación de los productos de PCR ……………. 22
1.3.8.- Análisis de secuencias ……………………………………. 23
1.4.- Resultados y Discusión…………………………………………….. 24
1.4.1.- Obtención e identificación de aislados de
Trichoderma spp ……………………………………………………… 24
1.4.2.- Diversidad de Trichoderma spp en plantaciones
de maíz de Venezuela ……………………………………………….. 49

1.4.3.- Aplicaciones biotecnológicas de los aislados de
Trichoderma spp obtenidos ………………………………………. 55
Capitulo 2. Biocontrol de R. solani …………………………………….. 60
2.1.- Introducción……………………………………………………………. 60
2.1.1.- Rhizoctonia solani como agente fitopatógeno ....... 60
2.1.2.- El cultivo de maíz …………………………………………… 63
2.1.3.- Mecanismos de control de Trichoderma spp ………. 65
2.1.3.1.- El micoparasitismo ……………………….. 65
2.1.3.2.- La antibiosis ………………………………….66
2.1.3.3.- La competencia ……………………………. 70
2.2.- Objetivos ………………………………………………………………… 71
2.3.- Materiales y Métodos ………………………………………………. 722.3.1.- Crecimiento en sustrato sólido ………………………… 72
2.3.1.1.- Ensayos en placas con PDA …………………… 72
2.3.1.2.- Ensayos en placas con suelo …………………. 73
2.3.2.- Crecimiento en sustrato líquido ……………………….. 73
2.3.3.- Determinación de los azúcares reductores ………… 74
2.3.4.- Determinación de N-acetil glucosamina ……………. 74
2.3.5.- Determinación de la actividad N-acetil
glucosaminidasa (quitinasa)……………………………………… 74
2.3.6.- Evaluación de las cepas en viveros …………………… 75
2.3.7.- Análisis estadísticos ……………………………………….. 75
2.4.- Resultados y Discusión ……………………………………………… 76
2.4.1.- Cultivos duales en sustratos sólidos …………………. 76
2.4.2.- Cultivos duales en medio líquido ……………………… 89
2.4.3.- Crecimiento de Trichoderma spp en suelo …………. 95
2.4.4.- Ensayos de vivero ………………………………………….. 992.5.- Discusión General ……………………………………………………. 105
2.6.- Conclusiones y Recomendaciones ……………………………... 110
2.7.- Referencia Bibliográficas ………………………………………….. 112
2.8.- Apéndice 1. Secuencias e identificación de los genes

ITS1 e ITS2 de algunas de las especies estudiadas ……………… 126
2.9.- Apéndice 2. Análisis de las secuencias tef1 con los programas
TrichoMARK y TrichoBLAST……………………………………………..

161

2.10.- APENDICE 3. Análisis Estadísticos ……………………….....

192

INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema representativo de los genes ribosomales,
mostrando la ubicación de las regiones ITS ……………..………..

13

Figura 1.1. Mapa de Venezuela mostrando los sitios de
recolección de muestras edáficas en plantaciones de
maíz utilizadas en este estudio...