Microbiologia de organismos
Páginas: 5 (1229 palabras)
Publicado: 7 de diciembre de 2011
Newsletter Microbial
http://www.microbial‐systems.com
Núm.
3
Informaciones sobre Análisis Microbiológicos por PCR
Enero ‐ Febrero de 2009
La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR. Mitos y realidades
“De los tres pasos Introducción En PCR, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es críticos que comel analito. Por tanto, una buena muestra impliponen el análisisde ca siempre un correcto proceso de obtención de esta molécula a partir de material biológico. patógenos por La extracción de ADN consta de una etapa de PCR, la extracción lisis, que consiste en romper las estructuras el medio de ADN es quizás que confinanotracitoplasma y liberar alimplica su contenido y de purificación, que la el más desconoci- retirada de la solución final de la mayoría deelementos que pueden interferir en la PCR. do... ” “...las suspensiones densas de bacterias gramnegativas pueden liberar su ADN en condiciones bastante suaves... ”
• •
Lavado del pellet. Se realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse Recuperación. El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser secado completamente.
La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabomediante electroforesis en un gel de agarosa i posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o directamente al espectrofotómetro mediante espectro de absorción de 200 a 350 nm. El ADN purificado De los tres pasos críticos que componen el aná- se puede cuantificar con un espectrofluorímetro lisis de patógenos por PCR (Fig. 1), la extrac- mediante el uso de fluoróforos específicosción de ADN es quizás el más desconocido y (Picogreen®, Molecular Probes) sobre el que más control podemos ejercer. El paso 3 puede realizarse con la ayuda de mi-
Enriquecimiento
Extracción ADN
Detección PCR
Figura 1. La extracción de ADN es un paso clave en los análisis microbiológicos por PCR
La extracción del ADN de las células o virus donde se halla confinado es un paso previoen muchos procedimientos analíticos y diagnósticos.
Etapas en la extracción de ADN
nicolumnas equipadas con una membrana de sílica que retiene específicamente el ADN permitiendo el paso de las moléculas y sales que acompañan la reacción de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se eluye el contenido
“La incorporación de controles internos de amplificación en los kits permite el controldel nivel de inhibición de las reacciones...”
Los pasos necesarios para una correcta extrac- Inhibidores de la PCR ción y purificación del ADN mediante un proce- Se trata de substancias que interfieren con las dimiento químico son: ADN polimerasas termoestables ya sea mediante el bloqueo directo total o parcial de su activi1. Lisis de las células o virus. Las sales caotró- dad catalítica omediante la unión directa al picas ayudan a romper la estructura tridi- ADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas mensional de macromoléculas como las substancias interaccionan con los iones Mg2+ proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un Tabla 1. Principales substancias inhibidoras de la PCR detergente como el SDS es necesaria a meInhibidor Origen nudo paraeliminar las membranas. 2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. 3. Purificación. Consta de 3 fases:
Sales biliares Polisacáridos complejos Colágeno Grupo hemo Ácidos húmicos Melanina y eumelanina Mioglobina ProteinasasIones de calcio Urea Hemoglobina, Lactoferrina Inmunoglobina G (IgG) Heces Heces, material vegetal Tejidos Sangre Suelo, material vegetal Pelo, piel Tejido muscular Leche Leche, huesos Orina Sangre Sangre
•
Precipitación del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol i recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se...
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Núm.
3
Informaciones sobre Análisis Microbiológicos por PCR
Enero ‐ Febrero de 2009
La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR. Mitos y realidades
“De los tres pasos Introducción En PCR, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es críticos que comel analito. Por tanto, una buena muestra impliponen el análisisde ca siempre un correcto proceso de obtención de esta molécula a partir de material biológico. patógenos por La extracción de ADN consta de una etapa de PCR, la extracción lisis, que consiste en romper las estructuras el medio de ADN es quizás que confinanotracitoplasma y liberar alimplica su contenido y de purificación, que la el más desconoci- retirada de la solución final de la mayoría deelementos que pueden interferir en la PCR. do... ” “...las suspensiones densas de bacterias gramnegativas pueden liberar su ADN en condiciones bastante suaves... ”
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Lavado del pellet. Se realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse Recuperación. El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser secado completamente.
La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabomediante electroforesis en un gel de agarosa i posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o directamente al espectrofotómetro mediante espectro de absorción de 200 a 350 nm. El ADN purificado De los tres pasos críticos que componen el aná- se puede cuantificar con un espectrofluorímetro lisis de patógenos por PCR (Fig. 1), la extrac- mediante el uso de fluoróforos específicosción de ADN es quizás el más desconocido y (Picogreen®, Molecular Probes) sobre el que más control podemos ejercer. El paso 3 puede realizarse con la ayuda de mi-
Enriquecimiento
Extracción ADN
Detección PCR
Figura 1. La extracción de ADN es un paso clave en los análisis microbiológicos por PCR
La extracción del ADN de las células o virus donde se halla confinado es un paso previoen muchos procedimientos analíticos y diagnósticos.
Etapas en la extracción de ADN
nicolumnas equipadas con una membrana de sílica que retiene específicamente el ADN permitiendo el paso de las moléculas y sales que acompañan la reacción de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se eluye el contenido
“La incorporación de controles internos de amplificación en los kits permite el controldel nivel de inhibición de las reacciones...”
Los pasos necesarios para una correcta extrac- Inhibidores de la PCR ción y purificación del ADN mediante un proce- Se trata de substancias que interfieren con las dimiento químico son: ADN polimerasas termoestables ya sea mediante el bloqueo directo total o parcial de su activi1. Lisis de las células o virus. Las sales caotró- dad catalítica omediante la unión directa al picas ayudan a romper la estructura tridi- ADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas mensional de macromoléculas como las substancias interaccionan con los iones Mg2+ proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un Tabla 1. Principales substancias inhibidoras de la PCR detergente como el SDS es necesaria a meInhibidor Origen nudo paraeliminar las membranas. 2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. 3. Purificación. Consta de 3 fases:
Sales biliares Polisacáridos complejos Colágeno Grupo hemo Ácidos húmicos Melanina y eumelanina Mioglobina ProteinasasIones de calcio Urea Hemoglobina, Lactoferrina Inmunoglobina G (IgG) Heces Heces, material vegetal Tejidos Sangre Suelo, material vegetal Pelo, piel Tejido muscular Leche Leche, huesos Orina Sangre Sangre
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Precipitación del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol i recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se...
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