microbiologia de tejiso

PRÁCTICA INTEGRADORA.
ESTUDIO DE LA MICROFLORA DEL TEJUINO
ETAPA II: Cinética de la interacción de los microorganismos aislados del tejuino, durante la fermentación.

Metodología general.

A) Reactivación de los microorganismos aislados.
Para realizar los precultivos, se reactivarán cada uno de los microorganismos aislados, en 10 ml de caldo (PD para las levaduras, nutritivo para loscoliformes, bacterias amilolíticas y MRS para las bacterias lácticas). Se incubarán los tubos durante 24 horas a 37°C y 120 rpm.

B) Elaboración del pre-cultivo
Después de la reactivación de los microorganismos, se adicionan 2.5 ml de cada uno de los microorganismos a 25 ml de caldo almidón pasteurizado con piloncillo. Los matraces se incuban durante 24 horas a 30°C y 120 rpm.

C) Cinética dela fermentación

1) Inoculación de los cultivos en el fermentador.
Se adicionarán la proporción adecuada de cada uno de los pre-cultivos por cada microorganimos a 250 ml de jugo de piña con piloncillos, para llegar a un volumen final de 300 ml. Los matraces se incubarán durante 3 días a 30°C. Este procedimiento se realizará por duplicado.

2) Determinación de los parámetros de fermentación.Toma y tratamiento de las muestras.
Para la determinación de los parámetros durante la fermentación, de cada matraz se tomarán cada 24 horas durante 3 días a partir del tiempo 0, 10 ml de muestra. Las muestras se colocarán en tubos cónicos estériles. Para las determinaciones de próteínas, ácido láctico, acético, azúcares reductores, alcohol y pH, las muestras se centrifugan a 5,000 rpm durante15 minutos. Se coloca el sobrenadante en otro tubo cónico estéril. Se guardan en congelación el sobrenadante y la pastilla celular, hasta su uso.

Determinación de la biomasa.
A. En la determinación de la biomasa se emplearán las técnicas de conteo en gota de Miles y Misra, turbidimetría, placa vaciada y proteína de Bradford (ver anexo 1). Para las técnicas de placa vaciada y Miles-Misra, seutilizarán las muestras sin centrifugar, a las cuales se les realizarán, incluyendo el tiempo 0, diluciones hasta 10-6 en solución amortiguadora de peptonas. Las diluciones se sembrarán utilizando la técnica de conteo en gota, empleando el medio PDA acidificado para las levaduras, agar MRS con trifenil tetrazolium para las bacterias ácido lácticas, agar almidón para bacterias amilolíticas y agar MacConkey para los coliformes y para los hongos filamentosos se sembrarán utilizando la técnica de placa vaciada en medio PDA acidificado, para su cuantiicación. Las placas se incuban durante 48 horas a las condiciones óptimas para cada tipo de microorganismos (ver etapa 1).

B. Para la técnica de turbidimetria se utilizará la tecnica descrita en el anexo 1.

C. Para la técnica de Bradford setrabaja con la pastilla celular (la cual se observa en el fondo del tubo) siguiendo la técnica que se encuentra en el anexo 1. Es necesario realizar una curva de calibración antes de realizar la determinación.
Se realizará una correlación entre las tres técnicas.
Determinación de azúcares reductores
Para determinar azúcares reductores mediante la técnica de DNS, se toma del sobrenadante 100l de las muestras ya centrifugadas y se colocan en un tubo eppendorf de 1.5 mL (realizar por duplicado), siguiendo la técnica que se encuentra en el anexo 1. Es necesario realizar una curva de calibración antes de realizar la determinación.

Determinación de alcohol. (Método de microdifusión)
Para determinar la concentración de alcohol en los diferentes tiempos de la fermentación, se sigue elprocedimiento descrito para la curva estándar. Se agrega 100 l del sobrendante de la muestra en el tubo para centrifuga (Ver anexo I punto 4 de la técnica de determinación de alcohol). Los demás puntos se repiten hasta la lectura en el espectrofotómetro. Es necesario realizar una curva de calibración antes de realizar la determinación.

Determinación de pH.
La determinación del pH se le...