Microscopia confocal

MICROSCOPÍA LÁSER CONFOCAL
Ángel Martínez Nistal Servicio de Proceso de Imágenes. Universidad de Oviedo

1.- INTRODUCCIÓN La microscopía láser confocal es una nueva técnica de observación microscópica que está logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biología, materiales, geología, etc.) Su éxito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a lamicroscopía óptica tradicional (imágenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolución vertical y horizontal, etc.) y, sobre todo, a la posibilidad de obtener "secciones ópticas" de la muestra, lo que permite su estudio tridimensional. Aunque el principio de la microscopía confocal fue patentado hace varios años (Minsk, 1957) y los primeros microscopios basados en esta técnica que demostraron su validezfueron descritos por Petran et al. en 1968, su gran aceptación y espectacular desarrollo no ha tenido lugar hasta hace unos pocos años con el desarrollo del láser y de los ordenadores personales. La mayor parte de las muestras observadas con microscopía óptica son traslúcidas o, en el caso de ser opacas, su superficie de reflexión no se encuentra perfectamente pulida. En ambos casos la luzinteracciona con la muestra a varias profundidades por lo que la imagen que llega al observador presenta áreas borrosas debidas a la luz procedente de zonas fuera del plano de enfoque, lo que produce una degradación en el contraste y resolución de la imagen (figura 1 A).

Fig. 1. (A). Imagen de microscopía óptica de fluorescencia de un alga (Spyrogira). (B) Imagen del mismo tipo de muestra (Spyrogyra)obtenida con el microscopio confocal.

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Técnicas de imagen en biología

El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco (figura 1 B). Para ello se ilumina una pequeña zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminándose los haces procedentes de los planos inferiores ysuperiores (Boyde, 1988).

Detector

Diafragma (pinhole)

Fuente de iluminación

Espejo dicroico

Luz en foco Luz fuera de foco Objetivo

Plano focal Especimen

Fig. 2. Esquema del principio de la microscopía confocal. La luz procedente de los puntos fuera del plano focal es eliminada por el diafragma o pinhole.

2.- BASES INSTRUMENTALES Parte de la luz procedente de la fuente deiluminación atraviesa un primer diafragma, es reflejada mediante un espejo dicroico y se enfoca en un punto del espécimen mediante la lente de un objetivo. La señal emitida por el punto iluminado (fluorescencia o luz reflejada) vuelve por el mismo camino óptico, pasa a través del espejo dicroico y es enfocada en un detector, un segundo diafragma o pinhole es colocado delante del detector para eliminarlas señales procedentes de la zona fuera de foco (Figura 2). El principio del funcionamiento del Microscopio Confocal se basa en la existencia de dos diafragmas (pinhole), uno entre la fuente de luz y el objetivo y el otro entre el objetivo y el detector. Ambos pinhole deben de estar perfectamente alineados de forma que el segundo de ellos únicamente deje llegar al detector la luz procedente delplano focal. La utilización de un láser como fuente de luz permite focalizar la iluminación en una región muy pequeña de la muestra y con una gran intensidad.

Microscopía láser confocal

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Dado que sólo se ilumina una pequeña zona de la muestra (punto), para poder visualizarla se necesita un sistema de barrido que permita muestrear todos los puntos y un sistema de formación de la imagendonde se recoja la información de cada uno de estos puntos. El sistema de barrido puede ser de dos tipos: que el haz del láser se desplace por la muestra (beam scanning) o que sea ésta la que se desplace, mientras el haz permanece inmóvil (stage scanning) (Wright, et al, 1993). El primer tipo es el más comúnmente empleado, tiene la ventaja de una mayor velocidad de barrido y por tanto de formación...