microscopia de fluorecencia

Microscopio de fluorescencia
Miriam
Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa desapercibida.Descubierto en 1908 por Köhler y Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas luminosos.

Andrea
La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente enel año 1935 por Alexander Jablonski (107). Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de una mayor longitud de onda (de undeterminado color, verde, rojo, amarillo) (fig. 6-21). Es un fenómeno de luminiscencia de vida corta, emitida simultáneamente con la excitación.




(Figura 6-21.-Imagen que muestra el principio de la fluorescencia. Arriba se observa el rayo incidente (color azul claro) de una determinada longitud de onda, el cual es absorbido por las partículas fluorescentes (esferas naranja) que respondenemitiendo otra luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de onda mayor que la de la luz incidente. Tomado de Fluorescencia y fluorocromos (108).)
Los términos de fluorocromo y fluoróforo definen los siguientes conceptos: 
• Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes.
• Fluoróforo: Parte de unamolécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de fluorescencia.
Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a determinadas moléculas u orgánulos. Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la célula. Algunos colorantesdenominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta).


Mauricio
Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y de emisión específico que depende de la composición y estructura de la molécula fluorescente (tabla 6-1) (fig.6-22).Fluorocromo
Longitud de onda de absorción (nm)
Longitud de onda de emisión (nm)
Cascade blue
374-403
422-430
Fluoresceína (FITC)
494
520
Rodamina (TRITC)
540
570
Naranja de acridina
460-502
526-650
Yoduro de propidio
536
617

Problema: La utilización de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz empleadas, entonces no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido ala desaparición de la fluorescencia.
Fluorescencia: A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación excitante. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, según el color del colorante usado.
Epifluorescencia: Hoy día se utiliza mucho unmicroscopio de fluorescencia en el cual la luz es emitida desde arriba del preparado. Por lo tanto, el objetivo del microscopio actúa como lente iluminadora y de imagen.

Porites lobata (lóbulo de coral), muestra en vivo mostrando la respuesta pigmentación del tejido con fluorescencia roja (12x)

Epifluorescencia con triple banda (U / B / G) de excitación.

Darwin Lazo
CONSTITUCION FUNDAMENTAL:...