microscopia de fluorescencia de transmision de energia resonante o FRET

La microscopia de fluorescencia de energia transmitida resonante o FRET

DEFINICIÓN:
El FRET es una técnica fluorescente que permite la investigación de las interacciones moleculares. Estadepende de la transferencia de energía de un fluoróforo a otro fluoróforo cuando las dos moléculas se encuentran en proximidad cercana.
 
TECNOLOGÍA:
El FRET permite la investigación de interaccionesmoleculares más allá de los límites de la resolución teórica de la microscopia óptica. Esta está basada en la transferencia directa de energía de una molécula a otra, la cual puede ocurrir en distanciasmuy pequeñas (1-10nm). Se deben satisfacer las siguientes condiciones para el FRET:
La prueba donadora debe tener suficiente tiempo de vida para que ocurra la transferencia de energía
Las moléculasdonadora y receptora deben encontrarse a una distancia de 1-10nm.
El espectro de absorción del fluoróforo receptor debe traslapar el espectro de emisión fluorescente del fluoróforo donador(aproximadamente en un 30%).
Para la transferencia de energía, el donante y el receptor deben tener una orientación bipolar aproximadamente paralela
La transferencia de energía se demuestra apagando lafluorescencia donante junto con una reducción en el tiempo de vida fluorescente, y un incremento de la emisión fluorescente en el receptor. El FRET es muy sensible a la distancia entre los fluoróforos y sepuede usar para estimar las distancias intermoleculares. La imagen FLIM se puede usar asociado a los estudios FRET para identificar y caracterizar la transferencia de energía.
En microscopiaconfocal, hay varios métodos para estudios FRET. Estos incluyen: basado-en-filtros, blanqueamiento del receptor, métodos espectrales basados en FLIM. El método basado en filtros requiere de filtros de paso debanda y software especializado para corregir el cruce y sangramiento. El método de blanqueamiento del receptor requiere que el poder del láser blanquee a los fluoróforos. El análisis espectral...