microscopia de fluorescencia

Microscopia de fluorescencia
Rodrigo Oberdam

Objetivo
El objetivo de la práctica es el estudio, comprensión y dominio de la microscopia de fluorescencia mediante la observación de muestras con el microscopio Olympus BX61

1.-Introducción
La fluorescencia refiere al proceso mediante el cual un espécimen absorbe luz y irradia luz en una longitud de onda menor, en un intervalo de tiempoínfimo.
Su funcionamiento se basa en la propiedad de fluorescencia que tienen ciertas moléculas denominadas fluorocromos.
Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de onda determinada cuando son excitados por un fotón incidente de una longitud de onda característica. La parte de la molécula que emite la fluorescencia se denomina fluoróforo.
Laprincipal diferencia del Microscopio de Fluorescencia es que permite irradiar al espécimen con la luz de excitación y separar la luz fluorescente emitida, que es mucho más débil, de la luz de excitación. Así, sólo la luz emitida por el espécimen es detectada por el ojo o el detector (usualmente una cámara digital). Como resultado, las partes fluorescentes de la muestra brillan contra un fondooscuro con suficiente contraste como para permitir la detección. Cuanto más oscuro es el fondo, más eficiente será el instrumento. En la figura 1 se explica lo que ocurre cuando una muestra fluorescente se observa con un microscopio de fluorescencia.




2.-Equipamiento

Microscopio óptico epi-fluorescencia Olympus Bx61 (Figura 2)


El BX61 es un microscopio de investigación completamentemotorizado incorporado a la plataforma del estativo vertical tradicional. Todas las funciones principales del microscopio, como el enfoque, la iluminación, la selección de objetivos y la rotación de filtros pueden automatizarse por completo. Todas estas funciones pueden controlarse por computadora mediante un completo software de comandos. El BX61 es una plataforma ideal para sistemas automáticos degeneración de imagen que requieren:

Automatización de tareas repetitivas.
• Automatización de operaciones complejas y con plazos de tiempo.
• Utilización a distancia mediante redes o Internet.
• Secuencias temporizadas durante horas o días






2.1-Fuentes de luz:

Lámparas de mercurio a alta presiónSon las más utilizadas. Exhiben máximos discretos sobre un fondo continuo que proporcionan excitación en el rango del ultravioleta así como en las regiones azul y verde y amarillo. Como se puede comprobar en la figura 2.1.

Estas lámparas son caras, requieren unidades de encendido especiales y el coste de funcionamiento es elevado. La salida de la luz se va reduciendo con el tiempo debido alennegrecimiento del envoltorio de cuarzo. Nunca deben utilizarse más tiempo del recomendado por el fabricante ya que existe riesgo de explosión que dañaría el microscopio y llenaría la habitación de vapores de mercurio. Generalmente llevan un contador de horas incorporado.


2.2-Filtros para Fluorescencia

Los filtros juegan un papel muy importante en un Microscopio de Fluorescencia ya que sonlos que permiten separar la luz emitida de la luz de excitación. Básicamente hay tres categorías de filtros: filtros de excitación, filtros de barrera y espejos dicroicos usualmente combinados para producir un cubo de filtros como el
de la Figura 3. La selección de los filtros apropiados es la clave para que esta microscopía funcione.



Los filtros de excitación permiten que sólo laslongitudes de onda seleccionadas de la fuente de luz pasen a través del camino de iluminación del espécimen. Los filtros de barrera o filtros de emisión están diseñados para suprimir o bloquear (absorber) las longitudes de onda de excitación en el paso hacia el detector. Los espejos dicroicos son filtros especializados diseñados para reflejar las longitudes de onda de excitación y dejar pasar las de...