Microscopia

Material de Apoyo – Org. Celular y Tisular – CERP Centro – Prof. Alexander Cantou – 2009 (Tomado de Actividades Prácticas – Cátedra de Biología Celular – Facultad de Ciencias)

INTRODUCCIÓN A LA MICROSCOPÍA Parte 2
TIPOS DE MICROSCOPÍA DE LUZ 1) Microscopía de campo claro: En este tipo de microscopía la imagen es obtenida por simple transmisión de la luz a través del preparado. Como la luzdebe atravesar la muestra esta puede ser un aplastado, un dispersado o un corte muy delgado del espécimen. Si las muestras no poseen contraste, el mismo se genera mediante la tinción del espécimen utilizando colorantes que poseen afinidad por distintos elementos celulares. El procedimiento para obtener preparados histológicos implica una serie de etapas que se detallan a continuación: a) Fijación:Tiene por objetivo conservar la estructura celular o tisular de manera que ésta mantenga una estructura lo más similar posible a la estructura in vivo. Se utilizan para esto medios físicos (congelación, calor, desecación) o químicos. Los fijadores químicos son moléculas pequeñas que penetran rápidamente en la muestra estabilizando las moléculas que componen la muestra y evitando alteraciones enel preparado y la retracción del tejido. Además la fijación permeabiliza las células para permitir la entrada del colorante. Ejemplos de fijadores son el formaldehído, alcohol, glutaraldehido, etc. b) Inclusión: Muchas muestras son demasiado gruesas como para examinarlas directamente, por lo cual deben realizarse cortes finos (5-10 µm). Para realizar dichos cortes las muestras son embebidas en unmedio de soporte que les otorgue consistencia permitiendo una sencilla manipulación del material. Generalmente se utilizan ceras o resinas – por ejemplo, parafina - que en su estado líquido rodean y penetran en los intersticios de la muestra, y luego por enfriado o polimerización pueden ser transformados en un bloque rígido.

c) Corte: Se utiliza un aparato denominado micrótomo que posee unacuchilla muy afilada y un sistema de avance micrométrico de la muestra. Los cortes se colocan sobre un portaobjetos para su posterior tinción.

Figura 5. Esquema de un micrótomo. Una porción de tejido embebido en parafina es seccionada con una cuchilla de acero para luego teñir y observar al microscopio óptico. (Fuente: Alberts y cols., Molecular Biology of the Cell, 2004)

d) Tinción: Existeuna gran cantidad de colorantes que muestran distinta afinidad por elementos particulares de la célula. Entre los más usados se encuentran la hematoxilina y la eosina. El primero de ellos tiñe de violeta estructuras celulares aniónicas como el ADN, ARN y algunas proteínas. Por su parte la eosina tiñe de rosado estructuras catiónicas como ciertas proteínas, por lo cual constituyen un buen par pararealizar tinciones generales. 2) Microscopía de contraste de fases Los especímenes biológicos son generalmente transparentes, es decir que el contraste de la muestra es tan bajo que independientemente del aumento o del poder de resolución del microscopio, el objeto es prácticamente invisible. Entonces, cuando es necesario mantener inalterada la muestra, sin matarla o teñirla, la microscopíarecurre a técnicas que permiten incrementar el contraste natural. Este contraste se genera al transformar diferencias en el retardo del pasaje de la luz a través de la muestra, en diferencias en intensidad de luz que puedan ser captadas por el ojo humano o la cámara fotográfica. Los especímenes biológicos interaccionan con la luz de una forma que no es

uniforme, ya que retardan el pasaje de lamisma de manera variable dependiendo de la estructura celular que se interponga en su camino. Este retardo dependerá del índice de refracción o grosor de la estructura celular generándose un retardo que generalmente es de 1/4 El microscopio de contraste de fases está diseñado entonces, para generar contraste en los especímenes biológicos transformando las diferencias en desfasaje de las ondas en...