Microscopia

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El uso de la Histología en los sistemas de C u l t i vo i n V i t r o d e t e j i d o s

Dra. Ana Maria Gonzalez – ana@unne.edu.ar 2006

Micr otécnica ve getal
Uno de los principales objetivos o propósitos de una investigación anatómica es realizar el estudio de los eventos ontogenéticos y los cambios estructurales que se suceden durante el crecimiento desde el explante hasta elmaterial adulto. Citaremos a continuación algunos procedimientos básicos que deben tenerse en cuenta para la preparación de tejidos cultivados in Vitro para llevar a cabo un estudio histológico. Partimos de la base que se pueden realizar dos tipos de análisis, con microscopía óptica y electrónica de barrido. Por razones obvias son se describen aquí las técnicas de microscopía electrónica de transmisión.Las técnicas de rutina empleadas en anatomía vegetal incluyen tres actividades básicas: • • • Preparación de los tejidos vegetales para su estudio microscópico Observación y registro de las imágenes Aprendizaje del uso correcto de los equipos necesarios para ello: micrótomos, microscopio, cámaras fotográficas, etc.

Micr oscopía Óptica

Toma de muestras
Es necesario realizar observacionescuidadosas de los cambios en el explante para conocer con exactitud el material a trabajar. Esta información permite identificar el área de actividad donde el anatomista debe enfocarse para la preparación de la muestra y su posterior análisis. En la planificación del estudio anatómico del material cultivado in Vitro es importante estimar el número de explantes necesarios, lo que depende del número deejemplos puntuales a analizar. Los cambios pueden ocurrir inmediatamente de colocar el explante en el medio de inducción. Si no se conoce el timing de los procesos, lo más conveniente es realizar el muestreo a medida que se observan los cambios. Por cada cambio detectado se deben extraer un mínimo de 5 muestras, según algunos autores el mínimo es 10. Debe incluirse el tratamiento control.Curso de Postgrado: Cultivo in Vitro de tejidos – 2006

Fac. Cs. Agrarias

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Fijación
Consiste en detener los procesos metabólicos y estabilizar los componentes celulares. Es tal vez el paso más importante de todo el proceso. El material debe ser sacado del medio de cultivo o de la planta y fijado al mismo tiempo. Un procedimiento a tener en cuenta durante la fijación es un correctoseccionamiento del explante, en especial si éste es de tamaño considerable. La reducción del material permite acelerar la penetración del fijador, a la vez que permite orientar el material para el tipo de corte deseado. Tener un exceso de tejidos alarga el procedimiento, tanto en tiempo como en recursos. El volumen del fijador elegido debe ser de 10 veces el del material. La elección del fijador está enrelación directa al tipo de procesamiento posterior: microscopía óptica o electrónica. Para microscopía óptica, utilizando inclusión en parafina, el fijador más usual es:

FAA: Formol – Alcohol – Ac. Acético Alcohol 70% (ó 50%) Formol Ac. Acético

90 ml 5 ml

5 ml

Inclusión
Este procedimiento le confiere al material la resistencia al impacto de la navaja del micrótomo, a la vez quemantiene las diversas partes del material siempre en la misma posición entre sí. El método más usual es la inclusión en parafina o sustitutos comerciales (Paraplast R, Parawax R, etc.) Este medio de inclusión permite la obtención de cortes seriados, esenciales para este tipo de estudios histológicos, mediante éste tipo de cortes se puede reconstruir tridimensionalmente la forma del explante cortado. Sucosto es relativamente bajo, tanto en recursos como en equipamiento. Es el método más conveniente para grandes explantes. En la literatura hay numerosos protocolos disponibles. El proceso de inclusión en parafina involucra tres etapas:

I. Deshidratación
La parafina es insoluble en agua, por lo que ésta debe ser removida de los tejidos antes de su inclusión. El proceso consiste en el pasaje...