microscopia


Sesión Teórico-Práctica 5
Manipulación de muestras para su estudio al Microscopio Electrónico1

PARTE TEÓRICA2

5.1. Naturaleza y origen de las muestras.

5.2. Técnicas de preparación para la microscopía electrónica de barrido: fijación, deshidratación, desecación, montaje y metalización de la muestra.

5.3. Técnicas de preparación para la microscopía electrónica detransmisión: diferencias básicas con las de SEM.

Naturaleza y origen de las muestras

La clasificación de las muestras según su naturaleza y origen es la misma que vimos para la microscopía óptica. Dada las peculiaridades de trabajo en este tipo de microscopía, sobre todo por trabajar en vacío, hay que tener en cuenta que cualquier muestra independientemente de su naturaleza u origen deben estarcompletamente deshidratas y desecadas. La visualización de muestras mal deshidratadas o desecadas será muy deficiente o prácticamente imposible, excepto en (ESEM), que sí permite la visualización de este tipo de muestras. Por otro lado, las muestras inertes metálicas que conducen bien la electricidad se pueden observar directamente al SEM, pero el resto han de ser metalizadas (cubiertas deun metal conductor).
Técnicas de preparación para la microscopía electrónica de barrido: fijación, deshidratación, desecación, montaje y metalización de la muestra La preparación de muestras al SEM requieren de un proceso que no es ni complejo ni laborioso, aunque algunos de sus pasos deben ser muy preciso, como es el caso de la
desecación, para que la muestra se conserve lo más cercana ala realidad.

Fijación: Las muestras que se van a estudiar al SEM no requiere de una fijación específica o distinta a las ya indicadas en las técnicas de microscopía tratadas, es decir tanto las muestras fijadas para microscopía óptica como para el TEM pueden ser


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observadas satisfactoriamente en este tipo de microscopía. En general, la mayoría de estudios al SEM suelen decantarse por fijadores aldehídicos, ya que son los mayoritariamente utilizados para el TEM.
Postfijación. La postfijación en las muestras preparadas para el SEM es completamente facultativa, encontrando tanto referenciasbibliográficas en las que esta etapa esta considerada en el protocolo de tratamiento de la muestras, como referencias en las que se obvia completamente. El tetróxido de osmio es el postfijador más utilizado, tanto por su capacidad de fijar los lípidos, como por favorecer ligeramente el contraste de la muestra, sobre todo en aquellas cuyo patrón morfológico es muy sutil. Deshidratación: parael estudio al SEM, al igual que la TEM, la muestra se ha de deshidratar, ya que algo de humedad dentro del la cámara provocaría un mal
funcionamiento del microscopio, ya que el vacío no sería adecuado y el haz de

electrones se perturbaría. Normalmente la deshidratación se realiza en un gradiente creciente de alcoholes etílicos hasta etanol absoluto, aunque en algunoscasos es necesario deshidratar las muestras hasta acetona. El último compuesto de la deshidratación se denomina líquido intermediario.
Desecación: la desecación es el paso por el cual la muestra pierde súbitamente toda sustancia líquida, sin que se vea mermada la estructura o morfología de ésta. Para ello se utiliza un líquido de transición que tiene una sublimación muy rápida, para evitar todatensión superficial y que la muestra conserve un aspecto lo más cercano posible a estado natural. Existen diversas formas de llevar a cabo la desecación, pero las que mejor rendimiento dan son: el punto crítico y el tratamiento con compuestos orgánicos volátiles. El punto crítico se realiza en un dispositivo donde, a una temperatura de 31º y una presión de 74 bar, el CO2 líquido desplaza a la...