Microscopia

Biología Celular.

Microscopía

De luz fotónica (250nm)

• Estándar (campo claro)

Existen numerosos tipos de microscopios, adaptados para diferentes usos. Algunos emplean una fuente energética diferente: microscopios de rayos X, ultravioletas, infrarrojo, de rayos beta, de ultrasonidos, electrónicos, protónicos, de neutrones, etc. Por su amplia aplicación y relativamente bajo costo,en enseñanza e investigación se utiliza especialmente el microscopio óptico compuesto de campo claro convencional, perteneciente al grupo de los microscopios ópticos o fotónicos, que utilizan la fracción visible del espectro.

El microscopio óptico convencional es compuesto porque posee dos sistemas principales de lentes convergentes (ocular y objetivo), en cambio los microscopios simples olupas, de menor aumento, presentan un solo sistema de lentes biconvexas o plano-convexas montadas en una armadura metálica. La mayoría de los modelos actuales son binoculares, aunque también los hay monoculares. El microscopio compuesto convencional se denomina "de campo claro" o "de campo brillante" porque todo el campo se ilumina con una lente condensadora común, a diferencia de variedades queutilizan luz difractada, de fondo obscuro. Las muestras que utiliza el microscopio compuesto convencional deben ser traslúcidas y estar teñidas para entregar contraste.

• Fluorescencia
Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resoluciónmicroscópica, permitiendo una apreciación diferente de la información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa desapercibida.
La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente en el año 1935 por Alexander Jablonski (107). Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicosdenominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de una mayor longitud de onda (de un determinado color, verde, rojo, amarillo). Es un fenómeno de luminiscencia de vida corta, emitidasimultáneamente con la excitación.
Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes.
Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de fluorescencia.
Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y de emisión específico que depende de lacomposición y estructura de la molécula fluorescente.
|Fluorocromo |Longitud de onda de absorción (nm) |Longitud de onda de emisión (nm) |
|Cascade blue |374-403 |422-430 |
|Fluoresceína (FITC) |494 |520 |
|Rodamina (TRITC)|540 |570 |
|Naranja de acridina |460-502 |526-650 |
|Yoduro de propidio |536 |617 |

Tabla 6-1.-Algunos de los principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia y susrespectivos espectros de absorción y emisión en valores aproximados. Modificado de Costa J. 2004 (109).
 También existen fluorocromos intracelulares naturales, tales como nucleótidos de nicotina reducidos (NADH, NADPH), nucleótidos de flavina oxidados, clorofilas, proteínas fluorescentes (Green Fluorescent Protein GFP) y esto debe ser tomado en cuanta al realizar esta técnica con marcadores...