microscopio de fluorecencia







INDICE






INTRODUCCION
El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda.Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.
El fenómeno de la fluorescencia se produce cuando un electrón de un átomo absorbe toda la energía de una determinada longitud de onda de la luz, saltando aotros orbitales. Es una situación inestable durante la cual se emite la mayor parte de la energía que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a su orbital.





CONSTITUCION FUNDAMENTAL:
Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de lapreparación de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico común
Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta.
Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos:TIPOS DE FILTROS
*Filtro de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.
*Filtro de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta queescapan el espejo dicrómico. Corta completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo.
*Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación y la fluorescencia.
Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es reflejada y la longitud de onda más larga lo atraviesa.





COMPARACION CONMICROSCOPIO CONVENCIONAL
Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo. Otra diferencia radica en que la luz de iluminación (excitación) no está involucrada en la formación de la imagen. En este sentido la microscopía defluorescencia difiere de la microscopía normal en la cual la imagen es formada por la luz de iluminación.

FUNDAMENTO FISICO
La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra,las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación.
Ejemplo:
1. Primer filtro de excitación: selecciona laluz de la longitud de onda incidente. En el esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul)
2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz...