Microscopio De Fluorecencia

Microscopía de fluorescencia

Bibliografía: Light and video microscopy. Randy Wayne. Capítulos 4, 6 y 11 (los capítulos 2 y 3 para repasar óptica) http://www.olympusmicro.com/

Introducción:Microscopía de campo claro

contraste= (Im-Ib)/Ib Ib = intensidad del fondo Im= intensidad de la muestra Cómo podemos generar contraste para ver específicamente una molécula en estudio?

1Introducción: Fluorescencia

Microscopía de fluorescencia por epiiluminación

Detección

Iluminación

2

Iluminación
Lámparas de arco de mercurio LEDs (light emitting diodes)

• caras • rangoamplio de  • baja duración

• • • •

baratos rango estrecho de (salvo LEDs blancos) alta duración potencia ?

Separando luz de excitación de luz de emisión

“cubo” de fluorescencia

3Separando luz de excitación de luz de emisión: filtros y dicroicos
pasa bajo pasa alto

filtros pasabanda

espejo dicroico

Separando luz de excitación de luz de emisión: filtros y dicroicosdicroico
excitación
Transmisión

emisión

longitud de onda (nm)

4

Objetivos

El objetivo cumple doble función: ilumina la muestra y colecta la fluorescencia

Microscopía defluorescencia por epiiluminación

Detección

Iluminación

5

Microscopía de fluorescencia: un color, muchos colores.
Cómo medir al mismo tiempo fluorescencia de 2 sondas fluorescentes distintas?Microscopía de fluorescencia por transiluminación
filtro de emisión

filtro de excitación

Ventaja: se puede combinar con técnicas de generación de contraste (simultáneamente) Desventaja: muchocuidado con la alineación

6

Limitaciones de microscopía de fluorescencia
Se excita y observa un volumen muy grande de la muestra: la luz de fluorescencia fuera de foco disminuye el contraste de lamuestra

Cómo eliminamos la luz fuera de foco?

Microscopía confocal

elemento clave

7

Fuente de excitación: Láseres
Monocromáticos Coherentes Haz de luz “paralelo”

Iluminación...