Mini preparaciones de plásmidos

Mini preparaciones de plásmidos
INTRODUCCIÓN
Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena, de tamaño pequeño (2-5 kb) y generalmente de forma circular, que se encuentran presentes de manera libre en el citosol de muchas bacterias y de algunos eucariontes unicelulares Son fáciles de purificar a partir de cultivos bacterianos y permiten la incorporación de insertos de DNA de un tamañomáximo de aproximadamente 10 kb. Los plásmidos naturales contienen pocos genes propios, y ninguno es esencial para la viabilidad de la célula, por lo que pueden ser modificados sin afectarla. (Segal et al, 2013)
Como todas las moléculas de DNA, los plásmidos contienen una región específica llamada origen de replicación, que sirve como señal de inicio para la DNA polimerasa y asegura que el plásmidosea replicado por la célula que lo contiene. (Drlica, 1997)
Un aspecto importante de los plásmidos es el hecho de que hacen resistente a antibióticos a la bacteria que los contiene. Esto resulta sumamente útil para técnicas de ingeniería genética. (Drlica, 1997)
En el laboratorio, los plásmidos de DNA pueden ser introducidos en una bacteria por un proceso de transformación artificial. Para esto,la bacteria es tratada con una mezcla de cationes divalentes que provocan permeabilidad temporal a pequeñas moléculas de DNA. Aún bajo las mejores condiciones, los plásmidos se establecen solamente en una pequeña población de bacterias. Para identificarlas, se usan marcadores de selección codificados por los plásmidos. El utilizado en esta práctica es la ampicilina, un antibiótico que se une einhibe varias enzimas de la pared bacteriana que están involucradas en la síntesis de la pared celular. El gen de resistencia ampr que lleva el plásmido codifica para una enzima secretada en el espacio periplásmico de la bacteria, con una desintoxicación concomitante de la droga. (Segal et al, 2013)
De esta forma, los plásmidos pueden ser utilizados como herramientas para propagar grandes cantidadesde DNA de una secuencia dada o para obtener un medio de expresión de un gel en una célula anfitriona.
OBJETIVOS
Reconocer la importancia de los vectores de clonación por medio de la extracción de DNA plasmídico.
Comprobar la presencia del inserto clonado en dicho vector.
HIPÓTESIS
Al realizar la electroforesis a la muestra aislada de las bacterias competentes resistentes a la ampicilina(puesta en los medios de cultivo), se observará una franja clara que indique la presencia del plásmido en los organismos cultivados.
MATERIAL Y REACTIVOS
Material
1 vaso de precipitados de 250 mL
Microtubos de polipropileno
1 probeta de 500 mL
1 probeta de 10 mL
Cajas de puntas estériles
Cristalizador de aluminio

Equipo
Microcentrífuga
Vórtex
Cámara de electroforesis horizontal
Fuentede poder
Transiluminador UV
Horno de microondas


Material grupal que deben traer los alumnos
Cloro comercial
Recipientes cuadrados de plástico con tapa para tinción

Reactivos
Etanol al 96% y 80%
Agua estéril
Disolución 1
SDS 10%
NaOH 10N
Disolución 3
Agarosa
Amortiguador de carga para DNA con GelRed 6x
TAE 1x

METODOLOGÍA
.Aislamiento del pGLO
A partir del cultivo de E.coli sembrado con anterioridad por el porfesor se tomaron 1.5 mL y se colocaron en un microtubo. Este se centrifugó a 14,000 rpm durante 1 minuto y después se aisló el sobrenadante utilizando una pipeta y colocándolo en un vaso de precipitados con cloro. Se agregaron 200 L de la disolución 1 y se resuspendió con el vórtex. Después se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación seagregaron 400 L de la disolución 2 y se mezcló por inversión. Se puso en hielo durante aproximadamente 25 minutos hasta que se observó un precipitado. Después se centrífugo a 14,000 rpm durante 3 minutos y se transfirió el sobrenadante a otro tubo, al que se agregó 1 mL de etanol 96%. Este sobrenadante se centrifugó a 14,000 rpm durante 15 minutos para después descartar el sobrenadante...