Mitocondrias Aislamiento

contr

LIC. BIOLOGIA
LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR
Dra. María Burboa

AISLAMIENTO DE MITOCONDRIAS DE CELULAS ANIMALES

Garza Ceballos Andrea

AISLAMIENTO DE MITICINDRIASDE CELULASANIMALES

OBJETIVO: Nuestro objetivo en esta práctica sería aislar las mitocondrias del hígado de res para observación y su conteo , que se llevará a cabo en un hemacitómetro.
MATERIALES: Los materialesque se utilizaron en la práctica fueron estos.
-Higado de res
-Solución A: Solución Fría amortiguadora de homogeneización sacarosa-TE: sacarosa a 0.5M, EDTA 60 mM, Tris HCl 30mM,NaCl 1% Ph: 8.0-Solución B: Solución amortifuadora-TE especial para mitocondrias :EDTA 60mM, Tris-HCl 30mM,NaCl 1.5%Ph: 8.0
-Tubos centrifuga de 50ml
-Tubos Falcon 2063 de 5ml
-Centrifuga refrigerada de altavelocidad
-Solución de HCl para modificar PH
-Solución de NaOH para modificar PH
-Hielera
-Baño para hielo
-Hielo
-Mortero y pistilo (fríos)
-varillas de vidrio
-2 pipetas pasteur
-balanzasemianalitica
-Hemacitometro
-Microscopio

PROCEDIMIENTO
Se preparó el baño de hielo, se enfrió en mortero y pistilo asi como la varilla de vidrio tubos y las soluciones.
Pesamos 4gr del tejido dehígado de res y lo coocamos en el mortero frío con 15 ml de la solución A fría.
Se trituro completamente, lo centrifugamos en tubos de 5ml a 1,000xg durante 30 min. a 4°c, en este paso se presipitaron losrestos nucleares y celulares.
Se recuperó el sobrenadante que contenia a las mitocondrias y lo volvimos a centrifugar a 1,200xg durante 10 min.
De nuevo recuperamos este sobrenadante ycentrifugamos a 20,000 x g por 20 min a 4°c de nuevo.
Repetimos de nuevo la centrifugación a 20,000xg por 20 min; se desechó el sobrenadante y resuspendimos el pellet.
Se tomó una muestra de el pellet y seobservó en el microscopio.

RESULTADOS:
No vimos claramente las mitocondrias por problemas que hubo con los microscopios, por lo tanto no se hizo el conteo de mitocondrias; pero estamos seguros...