Modificación in vitro de genes

Ensayos con enzimas de restricción

Primero revisar la información técnica de las enzimas a utilizar antes de realizar el ensayo. Cada enzima tiene distintos tiempos de incubación que dependen dela cantidad y tipo de ADN a digerir. Si los tiempos son distintos, se aconseja cortar el ADN primero con la enzima que requiere más tiempo, y luego con la enzima más rápida. Siempre es buenorevisar primero la información técnica de las enzimas para ver que aconseja el proveedor.
* Si va utilizar un nuevo inserto comercial que viene en un plasmidio pUC, es aconsejable probar las enzimas derestricción por separado para asegurarse que no haya cortes indeseados.

1) Para un subclonamiento se utiliza comúnmente 1 µg de plasmidio como material de partida, tanto para vector como inserto.Realizar un ensayo de restricción de 20 µl final.

2) Una vez realizado el ensayo, cargar el volumen total del ADN digerido en un gel de agarosa al 1,5%. Correr el gel al menos 45 minutos (la bandaamarilla del Green buffer debe recorrer ¾ del gel y evitar que salga del gel). Teñir con RED GEL en TAE 1X hasta que se vean claramente las bandas en el gel (10 a 15 minutos deberían bastar).

3)Cortar con la ayuda de un bisturí las bandas directamente del gel. Ésto se debe realizar en el transiluminador UV, por lo cual es importante cubrir las manos y brazos de la irradiación directa yrealizar los cortes lo más rápidamente, exponiendo lo menos posible el gel a la luz UV.

4) Utilizar el kit de purificación para las bandas (Revisar el protocolo propio del kit). Se aconseja correr unnuevo gel de agarrosa al 1% para asegurar la pureza y peso del ADN deseados. Cuantificar el ADN purificado. Puede utilizar absorbancia a 260 nm o densitometría de las bandas del gel.

5) Guardarinserto y vector a -20ºC si no utilizarán de inmediato.

Ensayos de ligación.

Para realizar la ligación, asegurarse de que tanto el vector como el inserto de interés estén puros y se conozca sus...