Molecular Laboratorio


Universidad Nacional Andrés Bello
Facultad de Medicina
Departamento de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Biología Molecular
BIO-241









INFORME Nº2:

PURIFICACIÓN DE GFP Y BLOTTING DE PROTEÍNASINTRODUCCION


En el presente laboratorio se utilizaran la bacteria transformada con el plásmido que se obtuvieron del laboratorio N◦ 2 transformación celular.

La bacteria transformada, en la cual se expresa en presencia de arabinosa, una proteína que a la luz UV se ve verde fluorescente (GFP), es purificada de contaminantes bacterial utilizado una columnade cromatografía. (1)

La purificación de la proteína lleva varios pasos:

Crecimiento de cultivo bacterial
Concentración celular.
Rompimiento celular.
Separación de Proteína. (1)

Crecimiento de cultivo celular: En este procedimiento se inoculan las colonias generadas en la placa de cultivo rotulado LB/AMP/pGLO o LB/AMP/ARA/pGLO. El gen de la proteína fluorescente solo se expresa enesta última por que contiene el gen arabinosa.
El proceso se realiza cultivando colonias de la bacteria transformada en condiciones propias en medio de cultivo líquido con LB/AMP/ARA ideal para su aislamiento para luego mediante un proceso de centrifugación se debe concentrar en un espacio específico. (2)

Concentración y lísis bacterial: La centrifugación es una técnica que se utilizapara separar moléculas en base a su tamaño con alta velocidad.
La lisozima se utilizara para degradar la célula de la pared bacterial. (Membrana hecha de fosfolípidos) que separan el contenido celular del ambiente extracelular. (3)

Mecanismo de rompimiento celular:

Stress mecánico: Uso de trituradores que imitan acción de un mortero.
Sonificación: Ondas de alta frecuencia rompen lascélulas.
Uso de una enzima: Lisozima es una enzima que rompe las cadenas de polisacáridos de la pared celular.
Congelamiento. Ciclos de congelación continuos que rompen la pared celular, temperaturas por bajo los 0 ◦C. (2)

Separación de Proteínas: se realiza mediante un proceso llamado cromatografía, esta técnica se utiliza para separar proteínas en una mezcla compleja. Las bacterias contienenmiles de proteínas de la cual la proteína GFP puede ser separada.

Para esto se utiliza una característica especifica de GFP la cual es contener gran cantidad de residuos hidrofóbicos y por ende ser más hidrofóbica que el contenido restante intracelular. Es por esto que se utilizarán columnas cromatográficas de interacción hidrofóbica la cual será ideal para separar la proteína GFP. (3)OBJETIVOS


1. Obtener GFP de manera pura o aislada a través de los métodos de:

Crecimiento o amplificaron celular
Concentración celular
Rompimiento celular
Separación o purificación de la proteína


2. Realizar un Blottling de proteínas a través de la técnica de Dot Blot con rojo de
ponceauMATERIALES Y MÉTODOS


Micropipetas
Puntas de micropipeta
2 tubos eppendorf de 2 mL
Centrifuga
Baño termorregulado (37ºC)
Cubeta con hielo
Alcohol 70%
Mechero
Soporte universal
Pinza mariposa
Columna de cromatografía preparada
Gradilla
Transiluminador UV
Refrigerador
Pinza
Asa plástica estéril
Pipeta desechable plástica de 1 mL
3 tubos de ensayo
Soluciones buffer :TE, wash, Equilibrium, binding




















Procedimiento:

Concentración celular:

Tomamos 2 mL con la pipeta desechable plastica de un tubo de cultivo LB/AMP/ARA/DNA+ y es transferido a un tubo eppendorf, se lleva a centrifugación por 5 minutos a 13400 RPM, luego se bota el sobrenadante y se vuelven a tomar 2 mL de solución de cultivo, repitiendo esta operación...