Mono

UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR
FACULTAD DE MEDICINA
DOCTORADO EN MEDICINA

Laboratorio Practico No.2
“Determinación de Bilirrubina
Directa y Total”.

Nombre: Brajan Alexander Leon Argueta.

Grupo: A

Mesa: 4

Gabinete: 6

Docente:

OBJETIVOS.

Que al finalizar el laboratorio práctico el estudiante sea capaz de:

1) Aplicar la técnica de la determinación de Bilirrubina ensuero por el método enzimático modificado Jendrassik/Gróf.

2) Cuantificar Bilirrubina Total y Directa en suero.

3) Deducir la concentración de Bilirrubina Indirecta diferenciándola con la Bilirrubina Directa.

PARTE EXPERIMENTAL.

Material y Equipo.

* 4 Tubos de ensayo.



* Gradilla.

* Pipetas serológicas de 1 y 5 mL.

* Espectrofotómetro.* Baño de María (con agua a temperatura ambiente).

* Papel de aluminio.

Reactivos.

* Reactivo para Bilirrubina Total (TBR):

* Ácido Sulfanilico.
* Acido Clorhídrico.
* Cafeína.
* Benzoato de sodio.

* Reactivo T-Nitrito para determinar bilirrubina Total (TNR):

* Nitrito de Sodio.

* Reactivo para Bilirrubina Directa (DBR):

* AcidoSulfanilico.
* Acido Clorhídrico.

* Reactivo D-Nitrito para determinar Bilirrubina Directa (DNR):

* Nitrito de Sodio.

Muestra.

* Suero o plasma heparinizado. Evitar la hemolisis. Las muestras deben protegerse de la luz (cubrirse con papel aluminio).

METODO.

“Modificación Jendrassik/Gróf"

Principio del Método.
La bilirrubina reacciona con acido sulfanilicodiazotizado (DSA) formando un colorante en sueros ictéricos rojo azo (AZO Bilirrubina). La absorbancia de este colorante a 546 nm es directamente proporcional a la concentración de Bilirrubina en la muestra. Los glucoronicos de Bilirrubina solubles en agua, reaccionan directamente con DSA; mientras que la bilirrubina indirecta o unida a las albumina reaccionara con DSA solamente en presencia de unacelerador.

BILIRRUBINA TOTAL = Bb directa + Bd Indirecta.

Acido Sulfanilico + Nitrito de Sodio DSA

Bilirrubina + DSA Azobilirrubina Directa

Bilirrubina DSA + Acelerador Azobilirrubina Total

PRECAUCIONES.

1. Es importante asegurarse que el reactivo deBilirrubina de Nitrito se mezclen completamente antes de agregar la muestra.

2. Pueden reducirse los niveles de Bilirrubina si las muestras son expuestas a la luz. La hemolisis también baja los niveles de bilirrubina debido al efecto inhibitorio de la hemoglobina sobre la reacción de diazotizacion.


PROCEDIMIENTO.

Para bilirrubina Total.

1. Prepare 2 tubos de ensayoscompletamente secos y protegidos de la luz.



2. A continuación siga las instrucciones de acuerdo al cuadro siguiente (agregar los reactivos en el orden indicado):

TubosReactivos | 1Blanco | 2Tubo de Muestra |
TBR | 3.0 mL | 3.0 mL |
TNR | --------------- | 0.12 mL |
Mezclar complemente, incubar 5 minutos en agua de chorro |
SUERO | 0.3mL | 0.3 mL |
Mezclar, incubar a temperatura ambiente por 20 minutos |

3. Medir la absorbancia de la muestra (Tubo 2) contra el blanco (llevar a cero con el blanco, Tubo 1) a 546 nm.



Para Bilirrubina Directa:
1. Prepare 3 tubos de ensayos completamente secos y protegidos de la luz.



2. A continuación siga lasinstrucciones de acuerdo al cuadro siguiente (agregar los reactivos en el orden indicado):

TubosReactivos | 1Blanco | 2Tubo de Muestra |
DBR | 3.0 mL | 3.0 mL |
DNR | --------------- | 0.12 mL |
Mezclar complemente, esperar 2 minutos |
SUERO | 0.3 mL | 0.3 mL |
Mezclar, incubar a temperatura ambiente por 5 minutos |...