Moral

PROTOCOLO PARA EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE SANGRE (MÉTODO DE SALTING OUT MODIFICADO PARA MICROEXTRACCIÓN)

1. Tomar entre 0.2 y 0.5 ml de sangre total y agregarlos en 0.5 ml deSolución de Lisis I en un tubo Eppendorf.
2. Mezclar por Inversión e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos.
3. Centrifugar a 14000 RPM x 1 minuto.
4. Voltear el tubo suavemente paradescartar el sobrenadante y evitar que se salga el
precipitado. Escurrir en una servilleta limpia.
5. Adicional 1 ml de Solución de Lisis I y mezclar por inversión. Hacer vortex hastadesbaratar lo más posible el pellet o utilizar una punta aerosol resistente para desbaratar el mismo. Evite formar espuma.
6. Centrifugar a 14000 RPM x 1 minuto. Descarte el sobrenadante.7. Repetir los pasos 5 y 6 hasta lograr un pellet (Precipitado) de color totalmente blanco o transparente (2 o 3 veces mas).
8. Agregar al precipitado 400 uL de Solución de Lisis II y20 uL de Proteinasa K(10 ug/uL). Resuspender con punta Aerosol Resistente.
9. Incubar 30 minutos a 56ºC y hacer vortex periódicamente. Se puede dejar mas tiempo, incluso hasta el otrodía.
10. Agregar 300 uL de Solución NaCl 5M. Hacer vortex de 30 a 60 segundos. Centrifugar a 14000 RPM x 12 minutos.
11. Pasar 350 uL de sobrenadante a un tubo nuevo con 900 uL de Etanolabsoluto frió. Mezclar suavemente por inversión y observar la malla de ADN. En este paso se puede dejar hasta el otro día a –20ºC.
12. Centrifugar a 14000 RPM x 12 minutos.
13.Descartar el sobrenadante suavemente para evitar perder el pellet.
14. Agregar 1 ml de Etanol al 70%, mezclar por inversión durante 2 minutos y centrifugar a 14000 RPM durante 5 minutos.
15.Descartar suavemente el sobrenadante y dejar secar el pellet 20 minutos en la cabina extractora de gases.
16. Adicionar 100 uL de TE 1X. Si el pellet es aun muy viscoso, agregar más TE 1X.