mutagenesis

Biología y genética

1. Mutagénesis dirigida
La mutagénesis dirigida es un método de biología molecular que se utiliza para realizar cambios específicos e intencionales a la secuencia de ADN de un gen y cualquier producto de los genes. También se llama mutagénesis específica de sitio o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, se utiliza para la investigación de la estructura y la actividadbiológica de ADN, ARN, y moléculas de proteína, y para la ingeniería de proteínas. Con la disminución de los costos de la síntesis de oligonucleótidos, la síntesis artificial de genes ahora se utiliza de vez en cuando como una alternativa a la mutagénesis dirigida al sitio.
Fundamento
Los primeros intentos de mutagénesis se utilizan radiación o mutágenos químicos no específicos de sitio. Losanálogos de nucleótidos y otros productos químicos fueron utilizados más adelante para generar mutaciones puntuales localizadas, ejemplos de tales sustancias químicas son aminopurina, nitrosoguanidina, y el bisulfito. La mutagénesis dirigida se logró en 1973 en el laboratorio de Charles Weissmann usando un análogo de nucleótido de N4-hydroxycytidine que induce la transición de GC a AT. Estos métodos demutagénesis sin embargo, están limitados por el tipo de mutación que pueden lograr y no son tan específicas como métodos de mutagénesis sitio-dirigidas posteriores.
En 1971, Clyde Hutchinson y Edgell Marshall demostraron que es posible producir mutantes con pequeños fragmentos de fago? X174 y nucleasas de restricción. Hutchinson más tarde produjo con su colaborador Michael Smith en 1978 unenfoque más flexible para mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de oligonucleótidos en un método de extensión del cebador con ADN polimerasa. Por su parte en el desarrollo de este proceso, Michael Smith más tarde compartió el Premio Nobel de Química en octubre de 1993 con Kary B. Mullís, quien inventó la reacción en cadena de la polimerasa.
El procedimiento básico requiere la síntesis de uncebador de ADN corto. Este cebador sintético contiene la mutación deseada y es complementario a la plantilla de ADN alrededor del sitio de la mutación por lo que se puede hibridar con el ADN en el gen de interés. La mutación puede ser un único cambio de base, múltiples cambios de bases, deleción o inserción. El cebador de cadena sencilla se extiende, utilizando una ADN polimerasa, que copia el restodel gen. Por lo que el gen copiado contiene el sitio mutado, y se introduce entonces en una célula huésped como un vector y se clona. Por último, los mutantes se seleccionan.
El método original mediante la extensión de una sola cartilla era ineficaz debido a un menor rendimiento de los mutantes. La mezcla resultante contiene tanto la plantilla no mutada original, así como la hebra mutante,produciendo una población de mezclas de progenie mutantes y no mutantes. Los mutantes también pueden ser contraproducentes seleccionado debido a la presencia del sistema de reparación del ADN que favorece la plantilla de ADN metilado, lo que resulta en un menor número de mutantes. Muchos enfoques ya han sido desarrollados para mejorar la eficiencia de mutagénesis.
Mutagénesis de cassette
A diferenciade otros métodos, mutagénesis de casete no tiene por qué implicar la extensión del cebador con DNA polimerasa. En este método, se sintetiza un fragmento de ADN y, a continuación, inserta en un plásmido. Se trata de la escisión por una enzima de restricción en un sitio de la ligadura de plásmido y posterior de un par de oligonucleótidos complementarios que contienen la mutación en el gen deinterés para el plásmido. Por lo general, las enzimas de restricción que corta en el plásmido y el oligonucleótido son la misma, permitiendo extremos pegajosos del plásmido y el inserto para ligar el uno al otro. Este método puede generar mutantes en cerca de 100% de eficiencia, pero está limitado por la disponibilidad de sitios de restricción adecuados que flanquean el sitio que va a ser mutado.
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