Na-K_ATPasa y Mg-ATPasa Uc., 1967, seminario en español curso bio141C

LA LOCALIZACIÓN DE Mg-Na-K ACTIVO
TRIFOSFATO DE ADENOSINA
EN LAS MEMBRANAS FANTASMAS DE GLÓBULOS ROJOS.

VINCENT T. MARCHESI y GEORGE E. PALADE

RESUMEN

El método de la sal de plomo introducida por Wachstein y Meisel (12) para la demonstración citoquímica de la actividad de ATPasa fue modificada y usada para determinar los sitios de actividad en las membranas fantasmas de los glóbulosrojos. Estudios preliminares mostraron que la fijación de aldehído y concentraciones estándar de la captura del reactivo Pb(NO2)2 resultaron en una marcada inhibición de la actividad de estas membranas. Al reducir la concentración de Pb2+ e incubando glóbulos rojos fantasmas no fijados, más del 50% de la actividad total de ATPasa, el cual incluía un componente activado Na-K ouabaína sensible,pudo ser demostrado por un ensayo bioquímico cuantitativo. Pruebas citoquímicas, llevadas a cabo bajo las mismas condiciones, dieron un producto de reacción localizado exclusivamente a lo largo las superficies internas de la membrana fantasmas de para tanto Mg-ATPasa y Na-K-ATPasa. Estos hallazgos indican que la actividad ATPasa de los glóbulos rojos fantasmas resulta en la liberación de Pi en elinterior de la membrana fantasma en sitios dispersos en su aspecto interior. No hubo depósitos de productos de reacción en la superficie exterior de la membrana fantasma, por lo tanto ninguna indicación de que en la hidrólisis Pi de ATP, es liberado fuera de los fantasmas. Tampoco hubo ninguna diferencia clara en la localización de producto de reacción de Mg-ATPasa en contraposición a aquel deNa-K-ATPasa.


INTRODUCCIÓN

Una ATPasa1 activada por Mg2+, Na+, y K+, en lo sucesivo denominada Na-K-ATPasa, se encuentra asociado con la membrana celular (1-3) y fracciones de célula aisladas de una amplia variedad de tejidos (4-9). Estudios fisiológicos en glóbulos rojos fantasmas y los axones de calamar aislados han provisto evidencia que este ATPasa es parte de o funcionalmente asociado conel mecanismo de transporte activo de Na+ y K+ (10, 11). Similitudes entre el mecanismo de transporte activo y esta actividad de ATPasa incluyen requisito para ATP y Mg2+, activación por Na+ y K+ e inhibición específica de ambas por el glucósido cardíaco, ouabína.
Además a este Na-K-ATPasa, cada una de las preparaciones de la membrana y del microsoma mencionadas exhibe una actividad de ATPasa lacual depende solo en Mg2+ y no es inhibido por la ouabína. Esta segunda actividad, en lo sucesivo mencionada como MG-ATPasa, es de suponer que no se involucra en el transporte de catión, pero su relación exacta con el Na-K-ATPasa no está completamente entendida: las dos actividades han sido atribuidas a dos distintas enzimas o, al contrario, se considera como la representación dos distintosestados funcionales de una sola enzima.
Ambas actividades son conocidas por estar asociadas con la membrana del glóbulo rojo pero su localización en esta membrana se mantiene desconocida. Investigadores previos han intentado determinar los sitios de actividad de ATPasa en la membrana usando el método de precipitación de la sal de plomo de Wachstein y Meisel (12). Sin embargo, objeciones a estosestudios se han planteado sobre la base de que estos métodos usados no podían demostrar N-K-ATPasa ya que esta actividad fue o destruida por la fijación aldehído o inhibida por el metal pesado usado como reactivo de captura (13). Otras objeciones han señalado que, bajo las condiciones de los procedimientos citoquímicos actuales, podría suceder la hidrolisis no enzimática del ATP por plomo (14).
Elpresente estudio fue iniciado en un intento de responder las siguientes preguntas: (a) ¿puede un procedimiento citoquímico de ATPasa puede ser diseñado libre de las objeciones mencionadas? (b) ¿puede ser demostrado el Na-K-ATPasa de las membranas de los glóbulos rojos, y si es así, dónde está localizada la actividad en la membrana? (c) ¿ puede el Mg-ATPasas es diferenciado de la Na-k-ATPasa sobre...