Nada

DETERMINACIÓN DE SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD)

Preparación de Muestras: según protocolo general para enzimas solubles.

Protocolo

|REACTIVO |ALÍCUOTA|Cc FINAL |Ejemplo |
|Buffer de medida |csp 1 ml |  |780 ul |
|Xantina |100 ul|50 uM |100 ul |
|NBT |100 ul |0,1 mM |100 ul |
|Xantina Oxidasa |Vnec p/ΔAbs= 0,025/min | |5 ul |
|Muestra | | |15 ul |


Vf= 1 ml

1.En cubeta de plástico, agregar buffer de medida + xantina + NBT + xantina oxidasa. Medir absorbancia a ʎ= 560 nm, usando un método que grafique Abs=f(t), t med= 1 min. Probar con volúmenes dexantina oxidasa entre 5-10 ul hasta obtener ΔAbs= 0.025 U/min.


2. Una vez que se determina el volumen de xantina oxidasa, anotar el ΔAbs/min y agregar la muestra. Anotar el ΔAbs/minobtenido que debe ser menor al anterior.


3. Probar con 3 volúmenes distintos con cada muestra (entre 5-30 ul), haciendo siempre el blanco sin muestra.

4. Determinar proteínas enlas muestras por el método de Bradford.


Para tener en cuenta:
El gráfico de Abs=f(t) debe ser lineal.
El agregado de CN- inhibe la Cu, Zn-SOD.

Procesamiento de resultados

5.Graficar en semilog b/a= f(ul mtra), siendo a= ΔAbs/min sin muestra y b=ΔAbs/min con muestra. Cuando b/a= 0.5, ese volumen de muestra agregado contiene 1 UI de SOD.


6. Calcular UI SOD/mgproteína según:



UI SOD/ mg proteína = 1 UI SOD
Vmtra (ul). 103. mg/ml prot

Donde Vmtra es el volumen de muestra que produce un 50% de inhibición (b/a= 0.5)