Observación Microscópica De Bacterias

ANEXO-Laboratorio Nº 1

OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS.

El examen microscópico de microorganismos constituye una de las técnicas características de la Microbiología y aunque es posible observar ciertos microorganismos sin colorear (Ej. protozoarios), en el caso de las bacterias se hace necesaria la coloración de los preparados para aumentar el contraste con el fondo.Para obtener el máximo aprovechamiento de la observación microscópica, debe poder relacionarse el comportamiento tintorial con la estructura y composición química de las diferentes partes de la anatomía bacteriana.

Colorantes y mordientes.

[pic]
Los colorantes utilizados en Microbiología son compuestos orgánicos que contienen grupos cromóforos y auxocromos unidos a anillos aromáticos[1].La presencia de grupos cromóforos en una molécula (grupos azo, nitro, etc.) no es suficiente para que ésta actúe como colorante, esto es que se fije a las estructuras a colorear. Para ser colorante debe poseer grupos que sean capaces de disociarse llamados auxocromos. Por ejemplo el 1,3,5 trinitrobenceno, es un compuesto coloreado pero no es un colorante. Sin embargo, si se reemplaza un Hpor un OH en el anillo bencénico, se obtiene el ácido pícrico que también es coloreado pero al poseer un grupo disociable (auxocromo) actúa como colorante.
La distinción entre colorantes ácidos y básicos depende de la carga de la parte de la molécula responsable del color. Si es negativa se trata de un colorante ácido y si es positiva se trata de un colorante básico. Esta diferencia esimportante debido a que, según sean ácidos o básicos, los colorantes tendrán afinidad por diferentes zonas de la anatomía celular.
Algunos colorantes utilizados comúnmente en Microbiología son fucsina básica, cristal violeta, safranina, azul de metileno, etc.
[pic]
En algunas coloraciones se utilizan sustancias capaces de formar complejos insolubles con los colorantes y que ayudan alproceso de coloración: los mordientes. Ejemplos de mordientes comúnmente usados son el Lugol, el ácido tánico y algunas sales.
Lógicamente, es de esperar que el colorante imparta su color a las estructuras celulares, sin embargo hay un fenómeno llamado metacromacia en el cual se observa un color diferente. Por ejemplo, pueden visualizarse corpúsculos metacromáticos rojos en ciertospreparados teñidos con azul de metileno. Una explicación que da cuenta de este fenómeno se muestra en la figura. El colorante, al interaccionar con ciertas estructuras polianiónicas como los polifosfatos, se dispone de tal manera que cambia la longitud de onda de absorción[2]. Pueden observarse corpúsculos metacromáticos (gránulos de volutina) en varios géneros microbianos y en general, su presenciadenota algún déficit nutricional en el medio de cultivo.

PREPARADOS PARA MICROSCOPIA OPTICA. PROCEDIMIENTO GENERAL.

Los pasos fundamentales previos a una coloración son: extendido, secado y fijado.

a) Extendido: se coloca una pequeña porción de la muestra en un portaobjetos y se extiende con el ansa en forma de óvalo. Para muestras provenientes de medios sólidos, debe colocarsepreviamente una gota de agua sobre el portaobajetos.
b) Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o colocar a 30-40 cm sobre la llama del mechero.
c) Fijado: la fijación tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la coloración así como también preservar la forma original de los microorganismos.
El procedimiento más común es pasar el preparado 3veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta técnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos más suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetróxido de osmio, ácido pícrico, etc.
Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloración, los preparados pueden contener...