obtecion de albumina bovina

a.Obtención de albúmina por precipitación con sulfato de amonio
1. Precipitación del fibrinógeno.
Se prepararon 100 ml de solución acuosa de sulfato de amonio 11,94 por ciento (Chemische Febrick
Lenkte), cloruro de sodio 0,85 por ciento y azida de sodio 0,1 por ciento y se mezcló con 100 ml de plasma. Se dejó 24 horas en refrigeración y se separó el sobrenadante por filtración (filtro rápidoWhatman N° 42).
2. Precipitación de globulinas
Se ajustó la concentración de sulfato de amonio al 23,4 por ciento en el sobrenadante, agregando 100 ml de una solución al 47,7 por ciento de la sal, con agitación constante, durante una hora; se refrigeró durante 24 horas. Se filtró el sobrenadante usando papel de filtro retentivo (Whatman N° 1, 50 cm diámetro), y se ajustó a 30 por ciento desulfato de amonio agitando por una hora. Se dejó en reposo 24 horas y se filtró de igual manera que en el paso anterior, procediendo luego a dializar con agua en frío, usando membranas de 2,5 cm de diámetro (Kalle Control 3591/1) con agitación constante. Continuamente se hicieron cambios de agua, hasta que las pruebas de turbidez con cloruro de bario mostraron menos de 0,008 por ciento de sulfatos.
Alos sobrenadantes que resultaron de cada paso de precipitación se les determinó la concentración de albúmina y proteínas totales (8,24). Al mismo tiempo, se les practicó una electroforesis de proteínas en acetato de celulosa (Titan III Helena) con bófer de dietil barbituratos, pH 8,6 y tinción con Ponceau, registrando las respectivas fracciones en un densitómetro (Quick Scan, Helena Lab.).
Elsobrenadante final rico en albúmina, fue liofilizado y almacenado en refrigeración. El polvo de albúmina se pesa y se diluye luego en solución salina, de acuerdo a la concentración requerida, agregando caprilato de sodio como estabilizador y se esteriliza en un equipo Millipore con filtros de poro 0,22 μm.
b. Obtención de albúmina por fraccionamiento alcohólico.
1. Precipitación de impurezas
Sediluyó 100 ml de plasma bovina en 200 ml de solución salina al 0,85 por ciento y se ajustó el pH a 5,6, usando bófer acetato 0,8 M pH 4,0 y se colocó en un baño a -5°C, agitando por una hora.
Lentamente se agregó etanol al 95 por ciento (Merck, Sharp and Dohme Research, Laboratories, West Point, PA 19486, USA), enfriado con anterioridad a -5 °C hasta obtener una concentración final de 42 porciento (v/v).
Se tuvo el cuidado de que la temperatura de la mezcla no sobrepasara los 0°C. Se agitó durante una hora a -5 °C, para luego centrifugar a 3000 rpm durante una hora a -5°C. Se descartó el precipitado.
2. Precipitación de albúmina
Utilizando el bófer acetato se ajustó el pH del sobrenadante a 4,8, y se agitó durante una hora a -5 °C, dejándose luego en reposo durante 3 horas. Secentrifugó la mezcla a -5 °C durante una hora a 3000 rpm.
El precipitado de albúmina se reconstruyó en 20 ml de agua destilada y se liofilizó. El polvo de albúmina se pesa y se reconstituye en solución salina hasta la concentración requerida, agregando
caprilato de sodio como estabilizador, se esteriliza en un equipo Millipore en filtros de poro 0,22 μm (Millipore Corp. Bedford, M.A. 07130, USA).A los sobrenadantes que resultan de cada paso, se les determinó la concentración de proteínas totales, albúmina y electroforesis siguiendo el mismo procedimiento citado para el método de sulfato de amonio.








Resultados
En la purificación de albúmina del plasma bovino, usando alícuotas idénticas para ambos procedimientos, se obtuvo una recuperación del 59 por ciento delfraccionamiento con sulfato de amonio y de 68,5 por ciento para el fraccionamiento etanólico. Por su parte, la pureza del producto final fue de 78,9 por ciento de albúmina para el primer método y de 97,8 por ciento para el segundo, quedando respectivamente un 21,1 por ciento y un 2,2 por ciento de globulinas como impurezas (ver Cuadros 1, 2 y 3).
Los resultados de los análisis electroforéticos se muestran...