Obtencian de anticuerpos anti-a en conejos

PRACTICA N° 2
OBTENCIAN DE ANTICUERPOS ANTI-A EN CONEJOS
OBJETIVO: Que los alumnos realicen un protocolo de inmunización para la obtención de anticuerpos de conejo, empelando antígenos celulares.

INTRODUCCIÓN
Cuando un animal es inmunizado con un determinado antígeno, se produce una respuesta con producción yproliferación de múltiples clones de linfocitos en el animal, obteniéndose de su sangre un suero policlonal, con una amplia variedad de anticuerpos de diferente especificidad y afinidad.

Un clon derivado de la reproducción de un único linfocito producirá, por definición, anticuerpos monoclonales, con especificidad única. La imposibilidad de obtener cultivos de clones celulares de linfocitos-Bnormales que produzcan los anticuerpos de especificidad deseada ha llevado a buscar las técnicas artificiales que emulen una situación similar. Con tal fin, se pueden llevar a cabo dos procedimientos: la transformación in vitro de los linfocitos B (p.e. mutagénesis mediada por medio de virus oncogénicos) y la fusión de las células productoras de anticuerpos con células de mieloma las cualesconfieren inmortalidad a las células B. Esta última es la base de la tecnología de producción de anticuerpos monoclonales, iniciada en 1975 por Kohler y Milstein y que, en esta última década se ha desarrollado enormemente, constituyendo una herramienta muy valiosa en múltiples estudios.

La contribución al desarrollo de los anticuerpos monoclonales les llevó a dichos autores a obtener, junto a NielsJerne, el Premio Nobel en Medicina en 1984.
La obtención de anticuerpos monoclonales consiste básicamente en inmunizar animales (ratones Balb/c generalmente) contra el antígeno para el que se desea producir anticuerpos. Tras obtener una respuesta adecuada se aislan del animal los linfocitos B esplénicos (capaces de producir anticuerpos) y se fusionan por medio de polietilenglicol con células delíneas establecidas de mieloma, tumor del sistema inmune
MATERIAL
* 1 conejo
* 5ml de eritrocitos humanos de tipo A
* 1 jeringa de 5ml
* 2 tubos cónicos
* 1 tapón
* 1 pipeta de 5ml
* 1 pipeta de 1ml
* 1 pipeta Pasteur con bulbo
* 1 centrifuga
REACTIVOS
* Buffer salino de fosfatos(PBS)
* Xileno
* Alcohol
* Heparina

METODOLOGÍA
1. Obtener 10ml de sangre tipo “A” por punción venosa y vaciarla a un tubo con anticoagulante
2. Centrifugar el tubo a 1800 rpm, durante 10min
3. Retirar con la pipeta Pasteur el sobrenadante y lavar las células, tres veces con buffer de fosfatos a 1800rpm durante 10min.
4. Después del último lavado, retirar con lapipeta Pasteur el sobrenadante y preparar una suspensión de eritrocitos al 10%en volumen de 5ml.
5. Seguir el siguiente esquema de inmunización, aplicando 1ml de la suspensión de eritrocitos de carnero al 10% por kilogramo de peso del conejo.
DIA | VIA DE INMUNIZACIÓN |
1 | Subcutánea |
3 | Intramuscular |
6 | Intramuscular en una pata |
9 | Intramuscular en la otra pata |
12 |Intravenosa |
15 | Subcutánea |

6. Dejar descansar al conejo durante cinco días
7. Tomar una muestra de sangre del conejo inmunizado, de la siguiente manera:
a) Colocar en la nariz del conejo un algodón con éter y esperar unos minutos para que se tranquilice
b) Limpiar las orejas del animal con alcohol al 70 %.
c) Aplicar en las orejas xileno con un algodón y esperar 3min.d) Tener listos dos tubos de ensayo
e) Localizar la vena más dilatada introducirle una aguja.
f) Esperar a que gotee la sangre y recolectarla en los tubos

8. Centrifugar los tubos a 1800 rpm durante 10 min.
9. Recolectar en un tubo pequeño con una pipeta Pasteur todo el suero que se puede, cuidando de no contaminarlo con eritrocitos.
10. Etiquetar y tapar el tubo,...