Obtencion de rna

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“OBTENCION DE RNA TOTAL DE TEJIDO DE RATA”PROFR.: RAÚL SILVA GARCIA GRUPO: * 5to. SEMESTRE. |
CARRERA: * Q.F.B.T |
BIOLOGIA MOLECULAR
LABORATORIO

PRACTICA#5
OBTENCION DE RNA TOTAL DE TEJIDO DE RATA

* OBJETIVOS
* OBJETIVO GENERAL
Extraer RNA total procedente de tejidos de cualquier órgano de rata para realizar su cuantificación y separación por medio deelectroforesis.
* OBJETIVOS PARTICULARES
* Conocer y determinar la cantidad presente de RNA en diferentes órganos
* Obtener una muestra de RNA que será utilizada para técnicas de cuantificación y electroforesis.
* Observar las diferencias que existen durante la electroforesis de ADN y de ARN
* Determinar el peso molecular del RNA extraído por medio de electroforesis
* Conocer lafunción de los diferentes reactivos utilizados en las técnicas de extracción, cuantificación y electroforesis de RNA y el porqué de las condiciones en que esta se realiza.

* INTRODUCCION
OBTENCION DE RNA
La posibilidad de aislar RNA lo más intacto posible el análisis de la expresión génica. El éxito de cualquier extracción de RNA es totalmente dependiente de la eliminación de toda posiblecontaminación de ribonucleasas (RNAsas) que degradan el RNA durante y después de la extracción, provocando bajos rendimientos de RNA de longitud completa. Las ribonucleasas son enzimas muy resistentes y de gran actividad catalítica:
a) Son marcadamente resistentes al calor, manteniendo incluso una considerable actividad tras un ligero calentamiento; b) son activas dentro de un amplio rango de pH; c)usualmente no requieren cofactores para su actividad; c) algunas, como las RNAsas pancreáticas, se renaturaliran fácilmente después de un tratamiento con agentes desnaturalizantes (p. ej., urea). El contenido de RNAsas endógenas varía con el tejido que se estudia: páncreas y bazo son tejidos con muy altos contenidos de RNasas, mientras que riñón, hígado e intestino tienen niveles menores, aunqueno despreciables. Un problema adicional es que el contenido de mRNA en cualquier tejido es muy bajo: una célula típica de mamífero contiene aproximadamente 10-5 µg de RNA total, del que tan sólo 1-5% corresponde a mRNA 11, De ese mRNA, aproximadamente el 50 % lo constituyen clases de mensajeros presentes en un número de copias < 10 por célula 1.
Por esta razón, una pequeña contaminación deRNasas, tanto endógena (del propio tejido) como exógena (del material utilizado, soluciones, manos, polvo, etc.), puede suponer un problema serio, por lo cual se deben tomar algunas precauciones
* PRECAUCIONES Y METODOLOGÍA GENERAL
A diferencia del DNA, el RNA es muy inestable una vez obtenido el tejido, por la presencia de las RNasas celulares. Por ello resulta crítica la congelación del tejidoo su rápida homogeneización en la solución desnaturalizante. Una fuente potencialmente grande de contaminación con RNasas son las manos del investigador por las células epidérmicas que se liberan continuamente. Es por ello obligado el uso de guantes tanto al realizar la extracción como al preparar las soluciones. De fundamental importancia para una extracción de RNA intacto con éxito es laejecución de todas las fases tan rápidamente como sea posible, ya que esto elimina riesgos de contaminación. Los recipientes a utilizar deben ser de plástico y estériles, y si se quiere trabajar con recipientes de cristal es necesario calentarlos a 250º C durante 24 horas o más (ni siquiera el autoclavado nos garantiza la inactivación de ribonucleasas.
Hay que trabajar, además, con soluciones libres deRNasas contaminantes, y esto se consigue tratándolas previamente con DEPC. El DEPC (dietil pirocarbonato) es un agente alquilante que reacciona covalentemente y de modo inespecífico con las proteínas, pero es muy reactivo con los sitios activos de las RNasas, inactivándolas muy eficaz, aunque no absolutamente. El DEPC sobrante puede reaccionar con el RNA y es preciso eliminarlo autoclavando las...