Obtención de dna cromosomal

PRACTICA # 3

OBTENCION Y PURIFICACION DEL DNA CROMOSOMAL

OBJETIVO.

- Extraer y purificar DNA cromosomal de leucocitos.

MATERIAL Y REACTIVOS.

Centrífuga
Microcentrífuga
Agitadorvortex
Micropipetas de volumen variable (20, 200 y 1000 μl)
Tubos Eppendorf
Puntas para micropipeta
Gradilla para tubos Eppendorf
Guantes de látex
Papel higiénico
NaCl 1 M y de ésta soluciónpreparar otra al SmM que es la que se requiere
SDS 10%
NaCl saturado
Etanol al 70%
Sacarosa 1 M
Tritón x-100 (directo)
Tris base 1 M pH 7.6 (es importante que el pH sea exacto)
TTS: paraprepararlo se hace para 50 mL o 100ml, y no se recomienda preparar más, al menos que se tenga que hacer unas 30 extracciones a la vez. Para 50 mL: 500 μL tris base 1 M pH 7.6, 15 ml de sacarosa 1 M, 500 μl detritón x-100 y 34 mL de DDW estéril (agua destilada y desionizada); para preparar 100 mL son exactamente las mismas condiciones pero al doble.
H2O desionizada estéril.

PROCEDIMIENTO.

TÉCNICADE EXTRACCIÓN DE DNA DE LEUCOCITOS (TÉCNICA DE MILLER)

1. Extraer 3 ml de sangre periférica y colocarlos en tubo de 13 x 100 con EDTA al 10%. Posteriormente se transfiere la sangre a tubos de Falconde 10 ml y se adicionan 3 ml de TTS (tris-tritón-sacarosa)

2. Se centrífuga a 3000 r.p.m. durante 10 minutos o 10,000rpm por 2 minutos

3. Se decanta el sobrenadante ( en el fondo queda unbotón espeso que no se debe perder al decantar)

4. Agregar al botón 1ml de TTS y transferirlo a un tubo Eppendorf de 1.5 ml, homogeneizar fuerte (con la mano o con un vortex con disco agitador paratubos Eppendorf) hasta disolver el botón y centrifugar a 12 000 r. p. m. Durante dos minutos a 4°C.

5. decantar el sobrenadante y agregar 1 ml más de TTS y otra vez disolver el botón y centrifugarotros dos minutos a 4°C . (este paso se tiene que repetir hasta que se obtenga un botón blanco y también el sobrenadante).

6. Una vez que se haya decantado el sobrenadante blanco y da un botón...