Organizacion Sub-Celular

Universidad Andrés Bello Facultad de Biología
Laboratorio de Biología
Celular y Genética
Profesores: Alexis Rivas
Luciana Oliveira Cruz








LABORATORIO N°9
“ORGANIZACIÓN SUBCELULAR”

BIO133
















Autores:
-2013-

Introducción
Desde laaparición de la vida en la tierra se relacionó directamente con la aparición de complejos macromoleculares que permitieron un desarrollo estable y evolutivo de las células. Estas a medida que el tiempo pasaba se fueron lentamente diferenciándose en dos ramas, por un lado están las procariontes las cuales son aquellas primitivas es decir las primeras correspondiente a organismos unicelulares ysimples como las bacterias por otro lado tenemos las eucariontes pertenecientes a células más estables muy definidas, complejas y algunas diferenciadas.
Todos los animales (excepto organismos unicelulares) tienen células eucariontes estas a su vez contienen organelos que son definidos como complejos separados por membranas que cumplen una función específica. Dentro de las células es muy difícilcomprender y poder saber las funciones específicas de cada organelos por eso se ha implementado distintos procesos para poder separar estos organelos sin dañarlos y estudiar su función más a fondo y por separado.
Para esto se ocupa una técnica llamada fraccionamiento subcelular, es una técnica de laboratorio, tras la disgregación, en la que se intenta reagrupar las partículas, generalmente células uorgánulos celulares, en función de sus propiedades biofísicas. Mediante el fraccionamiento celular se consigue separar conjuntos homogéneos, por lo general de orgánulos, a partir de una población heterogénea de células.1
1. Disgregación o rotura (homogeneización) de las células y liberación de los orgánulos.
2. Macro filtración en la cual se filtra el tejido a analizar en un colador de gasa uotro medio
3. Purificación de componentes celulares o fraccionamiento celular propiamente dicho: Se aplican técnicas de centrifugación diferencial y en gradiente

Objetivos
En esta ocasión se trabajó con hígado de rata
Conocer las técnicas de homogeneización usadas en el fraccionamiento subcelular.
Comprender los fundamentos de la técnica de centrifugación usada en el fraccionamientosubcelular.
Comprender el concepto de moléculas marcadoras y su utilidad en la evaluación del fraccionamiento subcelular.


Materiales y métodos
Hígado de rata
Ultra turrax (licuadora)
Centrifuga Clínica
Tubos de ensayo
Tubos de laboratorio
Buffer de homogeneización
Para este práctico se divide en 3:
La primera etapa se divide en la homogeneización de la muestra de hígado por medio dela herramienta (ultra turrax) la cual realiza una licuación dejando el tejido totalmente fragmentado
En la segunda etapa se filtra la homogenización del hígado por medio de un embudo y una gasa como colador.
En la última etapa ocuparemos distintos niveles de centrifugación en nuestra muestra homogeneizada de 8 ml en total. Así a su vez se obtendrá muestras de pellet y sobrenadante que según lafase de centrifugación obteniendo organelos según su tamaño
P1= pellet 1 (núcleos)
P2= pellet 2 (mitocondrias principalmente >> etc.)
S1= sobrenadante 1 (mitocondrias, lisosomas, >> etc.)
S2= sobrenadante 2 (fracción Microsomal)
Se recomienda dejar las muestras en hielo para mantener casi intacta las estructuras a analizar)
(En algunos casos se ocupan compuestos con variable densidad paraobtener más pureza en la muestra de organelos)
En el experimento 2 se observará a 40x una muestra de P1 núcleos Resuspendidos en el buffer con tinción de azul de tripán y una sin tinción.
También se observara una muestra a 40x de P2 mitocondrias Resuspendidas en el buffer con tinción de azul de tripán y una sin tinción.
En el experimento 3 se separaran 4 tubos de ensayo 1 sin nada, 2 con...