Organizacion subcelular

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UNIVERSIDAD ANDRÉS BELLO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR
PROFESORES: ALVARO BECERRA
CARLOS ROSALES

TRABAJO PRÁCTICO Nº 5
ORGANIZACIÓN SUBCELULAR

AUTORES: IGNACIA PÉREZ OTÁROLASEBASTIÁN RAMIREZ ZDERICH
ALEXANDRA REYES VALENCIA
CONSTANZA TACCONE VERGARA

FECHA DE ENTREGA: 07-05-2010-2010- Bio 131 sección 25

INTRODUCCION

El fraccionamiento subcelular corresponde a una serie de sucesos o metodologías utilizadas para poder observar o reconocer partes celulares ya sean membranas, mitocondrias, núcleos, microtúbulos, etc. Para este mecanismo se necesitan de dos etapasque son, primero, la rotura de las células o tejidos y segundo, la separación de la fracción deseada. Las técnicas más comunes para la rotura de las células o tejidos son la sonicación, uso de detergentes que solubilicen membranas celulares, pasar las células a través de orificios de diámetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares y homogenización. Posteriormente a ello, lamuestra se centrifuga, es decir, se hace girar un tubo a alta velocidad para obtener un sedimento o pellet y así finalmente poder experimentar con este sedimento y ver con qué reacciona, concluyendo de esta manera cual es el contenido de este pellet. El fraccionamiento subcelular es un tipo de experimento bastante utilizado y es de gran utilidad para los científicos para conocer la composición de lascélulas y así ratificar si es que determinado tejido o conjunto de células posee tal tipo de membrana o reconocer si contiene un determinado organelo. Es por eso que en esta actividad se desarrolló este procedimiento para conocer los métodos del fraccionamiento subcelular y de qué manera podemos encontrar los organelos celulares mediante un campo gravitatorio utilizando una centrífuga delaboratorio.

Fuente: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/fraccionamiento.htm

OBJETIVOS

El objetivo principal de este laboratorio es comprender el uso de la técnica de fraccionamiento subcelular y de este manera poder reconocer componentes celulares a través de la centrifugación. Aprenderemos, además, a usar sustancias que nos ayudarán a identificarestos mismos

MATERIALES Y MÉTODOS

A) FRACCIONAMIENTO SUBCLULAR DEL HÍGADO

1) El primer paso fue la disposición de una muestra de hígado de ratón (Rattus novergicus) licuado previamente y agregado a un tubo de Falcon el que se introdujo en un frasco con hielo picado por 5 minutos para mantenerlo fresco y para minimizar la activación del daño generadopor fosfolipasas y proteasas. A esta muestra se le agregó 1 mL de IBc fresco y frío y se dispuso en una centrífuga de laboratorio para mezclar la muestra. La velocidad fue de 1600 RPM por 10 minutos.

2) Luego se transfiere el homogenizado a otro tubo e Falcon y se centrifuga a 2500 RMP por 10 minutos a 4°C.

3) Posteriormente, cuando se obtiene el sobrenadante, este se transfiere aotro tubo de centrifugación a 6000 RPM por 20 minutos.

4) Luego de los 20 minutos de centrifugación, se reserva el pellet o sedimento y se le añaden 1 mL de IBc (Buffer) para poder lavar la muestra obtenida y centrifugar nuevamente a 6000 RPM por 20 minutos a una temperatura no mayor a 4°C.

5) Procedimos a descartar el sobrenadante de la última muestra y se re suspendió el sedimento...