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La capacidad de la superficie de la célula endotelial para acelerar la inactivación del factor Va dependiente de la proteína C activada fue el evaluada utilizando bajas concentraciones de proteína C activada para minimizar la inactivación del factor Va independiente de la proteína S. Durante el período de incubación, la capacidad de la superficie de la célula endotelial para acelerar la tasa deinactivación del factor Va se elevó. Esto era debido a la presencia de proteína S (en o de ver) la célula endotelial, según lo indicado por su disminución a los valores basales en las cultivos que contenían la anti-proteína S purificados por afinidad de igG.
Cultivos mantenidos en presencia de 3 (alfa-bencilo acetonil) -4 hidroxicumarina no mostraron una mayor capacidad de la superficie de lacélula endotelial para acelerar las tasas de inactivación del factor Va dependiente de la proteína C activada (datos no mostrados). (Así, Por lo tanto )la proteína S proveniente de células endoteliales mantenidas en medio de crecimiento normal puede asociarse con la superficie de la célula y, en presencia de proteína C activada, promover la inactivación de factor Va.
Para complementar los estudiosbioquímicos presentados hasta el momento, los sitios intracelulares de proteína S se visualizaron inmunocitológicamente ( Figuras 5 y 6). La micoscropia de inmunofluorescencia mostró la proteína S de la celula endotelial concentrarse en el complejo de Golgi con algunos depósitos adicionales finas puntiformes en el citoplasma periférico de muchas de las células (Fig. 5a). Tras la adición decicloheximida a los cultivos, la tinción de inmunofluorescencia de la proteína S intracelular disminuyo mucho (Fig. 5b). En contraste con el endotelio, las células del músculo liso vascular y fibroblastos casi no tenían antígeno inmunológicamente demostrable (datos no presentados), compatible con su contenido mucho menor de proteína S. En la resolución del microscopio de electrón, la proteína S,demostrable mediante tinción con inmunoperoxidasa fue identificada intraluminalmente en cisternas de retículo endoplasmatico rugoso (figura 6A), en pilas distales ocasionales en la cara cóncava trans del aparato de Golgi (Fig 6b), y en adyacentes vesículas.
La proteína S también fue evidente dentro de vesículas 30- 120 nm en la periferia, cerca de la corteza celular, algunos de estos en aparenteproceso de fusión (Fig. 6 c). La presencia de la proteína S dentro del endotelio sugirió la posibilidad de un mecanismo para su rápida liberación en respuesta a las perturbaciones. Por analogía con el factor de von Willebrand (16, 26), consideramos si la elevación de calcio citosólico de células endoteliales podría mediar en la liberación de proteína S.
La incubación del endotelio con bajasconcentraciones del ophore A23187 deiones de calcio el (4) resultó en una rápida liberación del antígeno de la proteína S en el medio de cultivo (Fig. 7, Tabla I). En contraste con la liberación inducida por A23187 del factor de von Willebrand (26), que continúa más allá de 30 rain, secreción máxima de la proteína S por 5 rain. Aproximadamente el 50% del total de proteínas S intracelular es en este (grupo,pool) rápidamente liberable. De acuerdo con estos hallazgos, los estudios de inmunofluorescencia de la proteína S demostraron una aparente reducción en la intensidad de fluorescencia después de la exposición de endotelio a A23187 (Fig. 5c).
Similar a la liberación del factor von Willebrand por elendotelio (16, 26), la liberación de la proteína S es dependiente de la presencia de calcio en el medio(Tabla II). La inclusión de cloruro de lantano (10 zM), un antagonista de la afluencia del calcio (34, 38) también impide la liberación de A23187 estimulada por la proteína S (Tabla II) -. La evidencia adicional de que la liberación de A23187 inducida por la proteína S era un efecto específico mediado por calcio es sugerido por el hallazgo de que ionomicina, otro ionóforo de calcio (23), pero...