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PRACTICA No. 16MEDIO DE CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO EIDENTIFICACION DE ENTAMOEBA HISTOLYTICA

OBJETIVOS:

1.Que el alumno aprenda a realizar el medio de cultivo LES (suero de huevo de Locke) de Boeck y Drbohlav.
2.Observar las formas morfológicas de E. histolytica en un cultivo.

INTRODUCCION:
La E. histolytica es un protozoo peteneciente a la familia Entamoebidae, ordenamébida, claselobosea, phyllum sacomastigophora, descubierta en 1875 por Lösch en las heces de un ruso que presentaba disentería grave, este parasito causante de la amebiasis que es una infección que se manifiesta a nivel intestinal y extraintestinal  ya que es invasiva y recurrente,
E. histolytica en su trofozoíto con un tamaño de 15 a 20micras, con una movilidad activa en progresión, presentapseudópodos grandes en forma de dedos, un núcleo que difícilmente se logra observar.
Los primeros cultivos de E. histolytica, los obtuvieron Boecky Drbohlav en 1925, con su medio. Ellos han descrito dos variantes: LES (suero dehuevo de Locke) y LEA (Albúmina de huevo de Locke) los cuales se diferencian enla composición del sobrenadante.Los medios de cultivo son de gran ayuda para realizar un diagnosticocompleto enlas protozoos humanas aunque en la mayoría de laboratorios de Parasitología no se utilizan.

MUESTRAS BIOLOGICAS REQUERIDAS:
1 Muestra de materia fecal

MATERIAL

1 matraz erlenmeyer
1 matraz aforado de 1000 ml
2 tubos de ensayo
2 vasos de precipitados
1 pipeta Pasteur con bulbo
3 aplicadores
4 huevos
5 perlas de vidrio

REACTIVOS
AlcoholAgua destilada ............................ 1.000.0 ml
Cloruro de sodio NaCl .................... 9 g
Cloruro de potasio KCl .....................0.4g
Cloruro de calcio anhidro.................. 0.2g
Cloruro de magnesio MgCl2 ............. 0.2g
Bicarbonato de sodio ........................ 0.2g
Dextrosa ......................... 2.4g
Suero humano estéril

EQUIPO

Autoclave
Incubadora

TECNICA
: Medio de cultivoLES (suero de huevo de Locke) de Boeck y Drbohlav

PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR LA SOLUCION DE LOCKE

* .Se disuelven en 500 ml de agua destilada
* 9 g de cloruro de sodio
* .4 g de cloruro de potasio
* 0.2 g de cloruro de calcio anhidro
* Por separado se disuelven
* 0.2 g de bicarbonato de sodio.
* Se mezclan las dos soluciones
* Se agregan 2.4 g de dextrosa
* Sevacía la mezcla a un matraz aforado de 1000 ml y se afora hasta lamarca.

PROCEDIMIENTO PARA EL MEDIO DE CULTIVO
1.Se lavan 4 huevos, se limpian con alcohol, se rompen y se vacían en un matraz con perlas de vidrio
2.Se agregan 50 ml de solución de Locke y se agita enérgicamente
3.Se coloca suficiente mezcla de huevo con Locke, de tal manera que seinclinen los tubos a 30°
4.Se colocan lostubos en un coagulador y se calienta a 70° C hasta que sesolidifique.

Proceso de Esterilización

1.Se sacan los tubos y se esterilizan en autoclave a 15 lbs de presión,durante 20 min.
Se prepara el sobrenadante con una mezcla de 8 partes desolución de Locke estéril son una parte de suero humano estéril einactivado a 56°C durante 30 minutos.

Recomendaciones:
 
En caso de que se dude de laesterilidad del suero, se filtra a través de unamembrana. Se coloca el sobrenadante en cantidad suficiente para cubrir laparte inclinada. Se incuba durante 24 hrs para comprobar su esterilidad.

Sembrado

El inoculo se hace de la muestra preferentemente donde haya moco,sangre o ambos.
1.Si las heces son formadas la inoculación deberá hacerse con un aplicador de madera
2.Si sonliquidas con una pipeta Pasteur 
2.1.Un gramo será suficiente para la inoculación

CUESTIONARIO

¿ De acuerdo al control de esterilidad cuales son los factores a los quese debe de conservar el cultivo?

Debe incubarse durante 24 horas a 37 °C

¿Cuál es la fase infectante de E. histolytica?

El quiste tetranucleado

¿ Durante que periodos de tiempo un cultivo deE. Histolytica debe...