PCR 2

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA

• Introducción (historia)
• Tipos de PCR
• Fundamento de la técnica
• Pasos para la PCR
• Componentes para la PCR
• Ventajas y desventajas de la PCR.
• Aplicación de la PCR

OBJETIVOS
• Destacar los hechos históricos del

desarrollo de la PCR.
• Distinguir los diferentes tipos de la PCR.
• Describir los pasos de la PCR.
•Describir los componentes de la PCR.
• Indicar las aplicaciones de la PCR.

INTRODUCCIÓN

En Abril de 1983, Kary Mullis dio
a conocer la Técnica de reacción
en cadena de la Polimerasa o
PCR que es una técnica para
la síntesis "in Vitro" de
secuencias específicas de ADN.

En 1989, Science seleccionó el PCR
como
el
principal
desarrollo
científico, y la Taq polimerasa como
la molécula del año.
En1993, Kary Mullis recibió por este
descubrimiento el Premio Nobel de
Química.

PCR anidada:
consigue amplificar
muestras mínimas de
ADN a miles de
millones de
fragmentos.

PCR in situ: permite
la detección de ADN
en el mismo lugar de
la muestra, sin tener
que procesarla
primero con técnicas
de laboratorio. Se
suele utilizar para
biopsias o raspados
de células.

PCR con transcriptasa
inversa: eneste caso se utilizan
cadenas de ARN para detectar
moldes de ADN. Se utiliza la
enzima transcriptasa inversa, la
misma que utiliza el VIH entre
otros virus.

PCR múltiple: con
este tipo de PCR se
consiguen detectar
varios trazos de ADN a
la vez y con una sola
muestra.

PCR en tiempo real o PCR
cuantitativa: se añade un
componente fluorescente que
permite medir la luz. A más luz, más
cantidad delADN detectado.

La reacción en cadena de la
polimerasa
conocida como PCR
permite amplificar más de un millón
de veces un ADN obtenido a partir de
una región seleccionada del genoma,
siempre y cuando se conozca una
parte de su secuencia de nucleótidos.

Esta técnica se fundamenta en la
propiedad natural de las ADN
polimerasas para replicar hebras de
ADN, para lo cual emplea ciclos de
altas y bajastemperaturas alternadas
para separar las hebras de ADN recién
formadas entre sí tras cada fase de
replicación y, a continuación, dejar que
vuelvan a unirse a polimerasas para
que vuelvan a duplicarlas.

¿Qué necesitamos para hacer una PCR?

† DNA molde o templado:
contiene la región que queremos amplificar.

† Primers:
Secuencias cortas de DNA (oligonucleótidos) que delimitan la zona que
queremosamplificar. Deben ser complementarios a cada uno de los
extremos de la región a amplificar. Se sintetizan in vitro de un modo
preciso para que a partir de su región 3‟, la polimerasa inicie la síntesis
en dirección correcta
† Mezcla de los 4 desoxirribonucleótidos trifosfato que componen el
DNA.
† DNA Polimerasa: polimerasa capaz de resistir elevadas
temperaturas (TaqPol)

† Termocicladora: Unamáquina que haga ciclos controlados de temperatura
(Máquina de PCR)

Es la mezcla reactiva que contiene todos los
componentes químicos necesarios para la
amplificación de un segmento diana de ADN.
•Buffer
•Agua libre de nucleasas
•Primers (izquierdo y derecho)
•MgCl2
•ADN diana
•D-NTPs
•Taq Polimerasa (agregar de último)

BUFFER DE AMPLIFICACIÓN
Se trata de una solución tampón que mantiene el pHadecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen
KCl, Tris y MgCl2 .
El MgCl2 es el componente que más influye en la
especificidad y rendimiento de la reacción ya que los
iones Mg²⁺ son necesarios para la actividad de la Taq
polimerasa, es decir, actúan como cofactores de la
polimerasa.

• La concentración óptima de MgCl2 está

en tornoa 1,5 mM si se emplean
concentraciones de 200μM de cada uno
de los dNTPs.

PRIMERS

Pequeñas secuencias de ADN complementario que flanquean la secuencia de in

Reglas a seguir para la selección de los

1. La longitud de cada uno de los primers debe estar
comprendida entre 18 y 24 bases ya que se ha
comprobado que primers de mayor longitud (30-35 bases)
no aumentan el rendimiento y los...